[发明专利]MDRPA中merA基因的检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂merA基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。20世纪初人类又进一步开发了双胍类(CRAs)和季胺类消毒剂(quateraryammon ium compounds，QACs)。到了20世纪40年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和两性表面活性剂。直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用。尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。

merA基因编码二价汞离子还原酶，携带该基因的细菌专一性地对汞离子耐药。该基因广泛分布于革兰阳性和阴性细菌体内，可以在革兰阳性和阴性菌体之间相互转导，并且经常与抗生素耐药基因连锁于同一质粒如pSN 254上。Tung等将从健康儿童口腔中分离得到的革兰阴性细菌用100-200mmol的汞离子溶液反复诱导，然后通过DNA-DNA杂交和PCR技术检测merA基因的存在，结果表明，在8个革兰阴性菌菌属中检测到merA基因，它们分别是柠檬酸杆菌属、奈瑟菌属、不动杆菌属、埃希杆菌属、肠道细菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属和粘质沙雷菌。经过对不动杆菌和大肠埃希菌中分离到的1000bp基因进行测序，发现它们与金葡菌的merA基因的同源性高达95％-96％；与枯草芽胞杆菌的merA基因的同源性也高达89％-97％。

目前检测merA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。

发明内容

本发明的目的是提供多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂merA基因携带情况的PCR检测引物及其检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MDRPA中merA基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).merA基因正向引物：5’-cgagcaacccgaacatctac-3’；

(B).merA基因反向引物：5’-acttgcggatcggtgaac-3’。

本发明还提供了一种MDRPA中merA基因的检测方法，其特征在于，采用上述MDRPA中merA基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带merA基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成merA序列，构建携带merA基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的merA基因检测探针溶液；merA基因正向引物的序列为：5’-cgagcaacccgaacatctac-3’，merA基因反向引物的序列为：5’-acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因检测探针的序列为：FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ；

第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的merA基因正向引物溶液0.1-1ul、merA基因反向引物溶液0.1-1ul、merA基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；

第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带merA基因。