[发明专利]MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂QacEΔ1基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。20世纪初人类又进一步开发了双胍类(CRAs)和季胺类消毒剂(quatemaryammon ium compounds，QACs)。到了20世纪40年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和两性表面活性剂。直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用。尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。

QacEΔ1从质粒R751上的I类整合子中分离得到。该质粒最先从肺炎克雷伯菌中分离。核酸测序分析表明，其DNA整合酶基因的3′端有3个开放读码框(ORF1、ORF4和ORF5)，并且ORF1的100个编码子有94个与ORF4相同。它与QacC有高度同源性。Paulsen等把ORF1命名为qacE，ORF4命名为QacEΔ1，并且从表型耐药分析qacE对消毒剂的耐药谱与QacC相似，QacEΔ1对这些消毒剂呈较低水平的耐药。因此，QacEΔ1可能是由于携带磺胺(sulI)耐药基因DNA片断插入到ORF1之中进化而来，其最终导致编码的蛋白比ORF1白蛋白少了162氨基酸的羧基末端。荧光试验表明，QacE的耐药也是质子泵介导的。氨基酸测序结果表明QacE也属于小的多重耐药家族蛋白，并有四个跨膜片段。两者均对季铵盐类消毒剂(如苯扎溴铵、苯扎氯铵和溴化米芬)、双胍类化合物(如氯己定)、腙类化合物和染料耐药。QacEΔ1对季铵盐类消毒剂和染料的耐药水平低于QacE。进一步研究表明，与QacE相比，这些差异是由于QacEΔ1蛋白失去了第四个跨膜片段和羧基末端的高度保守残基所造成的。

目前检测QacEΔ1基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。

发明内容

本发明的目的是提供多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂QacEΔ1基因携带情况的PCR检测引物及其检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).QacEΔ1基因正向引物：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；

(B).QacEΔ1基因反向引物：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′。

本发明还提供了一种MDRPA中QacEΔ1基因的检测方法，其特征在于，采用上述MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacEΔ1基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacEΔ1序列，构建携带QacEΔ1基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因检测探针溶液；QacEΔ1基因正向引物的序列为：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′，QacEΔ1基因反向引物的序列为：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′，QacEΔ1基因检测探针的序列为：FAM-tggtcgggactcggc-MGBNFQ；