[发明专利]一种利用亲和双水相系统提高凝血因子Ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种提高分离、纯化凝血因子VIII及其类似物效率及其生物活性的方法，属于生物制药领域，其关键是使用共价连接凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，使得特征亲水高分子化合物表面具有凝血因子VIII特异性亲和结合位点。此特异性亲和结合位点不但使凝血因子VIII与特征亲水高分子化合物发生很强的亲和吸附相互作用，而且决定了凝血因子VIII可以富集分散在亲和双水相中的特征亲水高分子化合物相(上相)。本发明方法可以将凝血因子VIII从含凝血因子VIII的体系，包括表达基因重组凝血因子VIII的含成千上万种蛋白质的复杂细胞体系或含凝血因子VIII的人血浆中简单、快捷、特异性地分离出来，且纯度、生物比活性、回收率均大幅度提高。 

背景技术

凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。凝血因子VIII基因位于X染色体长臂末端(Xq28)，长为186kb，由26个外显子组成，其中第14号外显子为3.1kb，是目前发现的人类最大的外显子之一。凝血因子VIII mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体 多肽.去除N端19个残基的个信号肽后，成熟蛋自由2332氨基酸组成.氨基酸顺序分析表明，凝血因子VIII蛋白由3个A结构域，一个B结构域及2个C结构域组成。各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2，从血浆中及从重组细胞培养上清中分离纯化得到的凝血因子VIII是由两条肽链所组成，重链由A1-A2-B或A1-A2组成，分子量为90～200kDa不等；轻链由A3-C1-C2所组成，分子量为80kDa，二条肽链间由Ca2+连接。目前的研究表明，B结构域对凝血因子VIII的凝血活性并非必需。 

凝血因子VIII为血友病病人的救命药。然而，不论是以血浆为原料的凝血因子VIII生产法还是以表达基因重组凝血因子VIII细胞为原料的生产法，由于目前生产过程复杂，并且全部使用十分昂贵的抗体，即采用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析技术以纯化凝血因子VIII，致使其价格居高不下，且存在很多安全隐患(Clonis YD，Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop.J Chromatogr A.2006，1101(1-2)：1-24；Lowe CR，Lowe AR，Gupta G.，New developments in affinity chromatography with potential application in the production of biopharmaceuticals.J Biochem Biophys Methods.2001，49(1-3)：561-74)。尤其在中国，基因重组凝血因子VIII生产法技术迟迟未过关(拜耳属于进口技术除外)，而血浆制品市场来源有限，长期供应紧张，中国又限制血液制品进口，致使凝血因子VIII产品不但价格奇贵，而且总是缺货、断货。总体来说，全球凝血因子VIII药品目前主要的开发方向是，优化凝血因子VIII分离效率、纯化效率与生物比活性的方法，以便在保障其安全性的前提下，降低其生产成本。其中一个主要目标是研发替代生产用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析的纯化技术。小鼠源单克隆抗体亲和柱层析纯化法除成本高外，另有其它潜在问题或风险：例如，抗体或其片断在产品洗脱 过程中会从固定相脱落、进入流动相、进入人体，或是凝血因子活性降低，或带来潜在免疫原或由该抗体生产过程所带来的病毒以及未知病原体等(Mejan O，Fert V，Delezay M，Delaage M，Cheballah R，Bourgois A.，Immunopurification of human factor VIII/vWF complex from plasma.Thromb Haemost.1988，59(3)：364-71；Gomperts E，Lundblad R，Adamson R.，The manufacturing process of recombinant factor VIII，recombinate.，Transfus Med Rev.1992，6(4)：247-51)。全球各地科学家努力寻找可以替代上述抗体的小分子。可是，到目前为止，没有成功。 

发明内容