[发明专利]一种利用亲和双水相系统提高凝血因子Ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法

权利要求书

1.一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的简单、快捷方法。此方法基于应用亲和双水相技术，即将特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，与磷酸盐、或葡聚糖、或其它第二组份在水溶液中形成稳定亲和双水相，其核心技术之一是：实现PEG与凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体共价连接。凝血因子VIII优先地定位于连接了亲和小肽配位体的特征亲水高分子化合物相中，而来自细胞提取物的大部分蛋白(或称杂蛋白)倾向于移动至另一相。经过一系列洗涤操作以去除余下的杂质后，通过添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子，反转蛋白质的定位，或曰反向萃取。本发明包括改变目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，从而得以高效和高纯度纯化所述蛋白或多肽。本发明是关于一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的一种具有成本效益的办法。

本发明所涉及的方法与步骤，包括使用机械或化学方法将细胞破碎、与缓冲盐溶液混合、低速低温或常温离心、去除细胞破碎沉淀物、加入特征亲水高分子化合物，优选聚乙二醇(PEG)，及双水相成相成分、借助重力或离心力实现相分离并得到双水相、反复相分离，最后通过改变盐体系、盐浓度、pH值、或添加对结合至特征亲水高分子化合物的凝血因子VIII具有竞争性亲和力或可破坏、拮抗PEG-凝血因子VIII亲和吸附的可溶性分子等措施反转蛋白质相定位的一系列步骤。

2.根据权利要求1所述凝血因子VIII，其特征在于，所述凝血因子VIII主要是哺乳动物的凝血因子VIII，优选人凝血因子VIII，包括凝血因子VIII的异构体、突变体、基因修饰表达产物、融合表达产物即融合蛋白、化学修饰产物、酶切或化学切割片断(fragment)、部分基因表达成熟肽及其片断或区域(domain)，或片断、区域的连接体、组合体等。

3.根据权利要求1所述的凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体，其特征在于，所述凝血因子VIII特异性亲和作用小肽配位体(包括其化学改性异构体)结构式为：

NH2-(X-EY1C)-COOH

式中：NH2为小肽氨基端的α-氨基、X表示小肽氨基端的氨基酸亚级结构序列(包括：W、EYHSW等)或为3-吲哚乙酸(3-IAA)、E为谷氨酸、Y1为酪氨酸或与其左侧谷氨酸所形成肽键被还原成CH2的改性酪氨酸、C为半胱氨酸、COOH表示小肽羧基端羧基。按照上式，典型的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽有：

L1＝EYHSWEYC；

L2＝WEYC；

L3＝3-IAA-EYC，Y表示E-Y之间肽键上羰基未被还原；

L4＝3-IAA-EY1C，Y1表示E-Y之间肽键上羰基被还原成CH2。

4.根据权利要求1所述用于形成双水相的特征亲水高分子化合物，其特征在于，所述特征亲水高分子化合物是一种亲水性聚合物、且具有在水溶液中形成双水相的能力，所述特征亲水高分子化合物优选聚乙二醇(PEG)，而其中至少一种特征亲水高分子化合物为半胱氨酸巯基反应活性基团接枝的，优选马来酸酐接枝PEG，简写为Mal-PEG、或PEG-Mal，且具有Mal-PEG、PEG-Mal、Mal-PEG-SCM、DSPE-PEG-Mal、mPEG-Mal、NHS-PEG-Mal、Mal-PEG-Mal结构中的至少一种，优选Mal-PEG结构。

5.根据权利要求1所述亲和双水相系统，其特征在于，建立双水相时选用一种或两种特征亲水高分子化合物(其中至少一种是接枝改性的)混合物与有机盐或无机盐形成亲和双水相系统。可通过调节此系统的pH值、盐种类、盐浓度等参数来改变系统对凝血因子VIII的分配系数。

6.根据权利要求4所选特征亲水高分子化合物，其特征在于，特征亲水高分子化合物的分子量大小、分布范围及其相互混合比例是不受限制的，如PEG的分子量可以是300-6000道尔顿、300-2000道尔顿、或3000-6000道尔顿，但优选2000-5000道尔顿。