[发明专利]一种简单高效制备人γδT细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的方法。

背景技术

T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)的不同分为两类：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞，分别简称为αβT细胞和γδT细胞。其中γδT细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，大多数为CD4和CD8分子双阴性，少数可表达CD8分子。γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5％。γδT细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。但由于γδT细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞是十分困难的。虽然已有技术通过抗TCRγδ抗体或非肽磷酸类抗原获得大量γδT细胞，这无疑会增加其制备的成本。经广泛查阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，均未见有实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的发明或报道。因此发明一种实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的方法，对于γδT细胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力是非常重要的，对于攻克人类渴望解决的恶性肿瘤性疾病这一难题也是十分有价值的。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种实用高效的体外大量扩增人外周血γδT细胞的方法。克服现有制备γδT细胞数量不足、细胞毒性低、成本高的限制。

本发明所采用的技术方案是：一种制备人γδT细胞的方法，包括如下步骤：培养结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)并制备结核杆菌耐热性抗原(Mycobacterium tuberculosis heated antigen，Mtb-HAg)，采集并分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，用Mtb-HAg激活，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，置于37℃，5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为(0.5～2.0)×10⁶/ml。10～15天即可以获得大量、高细胞毒活性的γδT细胞。

根据本发明，所述的Mtb培养基为苏通式液体培养基或者Middlebrook7H9，Mtb经过高压蒸汽处理，并经离心超滤制备成Mtb-HAg。所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述Mtb-HAg的终浓度为5～10μg/ml，rhIL-2的终浓度为50～500IU/ml，rhIL-21的终浓度为5～20ng/ml。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10～15天。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

本发明的有益效果是：利用Mtb-HAg作为刺激剂，激活γδT细胞，并联合细胞因子rhIL-2和rhIL-21共同刺激培养γδT细胞，使获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要，同时与IPP等非肽磷酸类抗原、抗TCRγδ抗体等刺激剂相比培养成本大大降低。解决了现有技术体外培养γδT细胞数量低、毒性弱、成本高等问题。

具体实施方式

下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1

本实施例1是用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原。包括以下步骤：

1.将结核杆菌菌体种子湿重50～100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37℃培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10％～30％新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体。

2.将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115℃高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-HAg。

实施例2

本实施例2是用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，以获取大量、高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞。具体操作包括以下步骤：