[发明专利]一种组织工程软骨及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程软骨，其特征在于，所述的软骨为具有细胞活性的类天然软骨组织结构，由表层、中层、深层和钙化层依次层状排列的细胞膜片构成，主要成分为胶原基质；其中，表层由滑膜间充质细胞及其分泌的细胞外基质构成，在软骨组织微环境下所形成致密的纤维化软骨表层；中层由软骨细胞及其分泌的具有透明软骨特征的细胞外基质构成；深层由骨髓间充质干细胞诱导分化的软骨细胞及其分泌的细胞外基质构建，具有向肥大软骨细胞转化的特性；钙化层由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞及其分泌的细胞外基质构建；各层之间以胶原及透明质酸复合，在体外流体静压条件下培养后，能够促进各层软骨结构边界融合。

2.制备权利要求1所述组织工程软骨的方法，其特征在于，是采用软骨细胞、滑膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经诱导培养，分别制备成细胞膜片，以胶原及透明质酸复合，经体外流体静压条件下培养，得到具有天然层状结构和生理功能的组织工程软骨。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤一、制备软骨钙化层：取第3～4代骨髓间充质干细胞按0.5×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液A培养7～21天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞并形成膜状结构，完成软骨钙化层制备；所述培养液A的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10^-9～10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠2～20mmo l/L和抗坏血酸10～100μg/mL；

步骤二、制备软骨深层：将第3～4代骨髓间充质干细胞以0.2×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液B诱导培养7～15天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞并形成膜状结构，完成软骨深层制备；所述培养液B的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，转化生长因子β₁为1～20ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2为2～15ng/mL、地塞米松10^-8～10^-6mol/L、胰岛素5～15μg/mL、亚硒酸钠5～15μg/L、牛血清白蛋白1～5g/L、Vc为15～100μg/mL和丙酮酸钠75～200μg/mL；

步骤三、制备软骨中层：将1～4代的软骨细胞按0.5×10⁵/cm²～5×10⁵/cm²的密度接种在细胞培养孔板内，加入培养液C培养7～15天，每2～3天换液一次，完成软骨中层制备；所述培养液C的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL、Vc为50～100μg/mL、TGF-β₁为5～10ng/mL、bFGF-2为5～50ng/mL；

步骤四、制备软骨表层：将滑膜间充质干细胞以0.5×10⁵/cm²～8×10⁵/cm²的密度接种在步骤三制备的软骨中层表面，采用培养液D培养3～7天，完成软骨表层的制备及其与软骨中层的组装；所述培养液D的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～500μg/mL、Vc为25～100μg/mL、TGF-β₁为1～10ng/mL、bFGF-2为3～15ng/mL、地塞米松为10^-8～10^-6mol/L；

步骤五、组织工程软骨多层结构的组装：将上述制备的各层软骨组织，按层状排列由上到下分别为：表层、中层、深层与钙化层，各层之间采用以2～8mg/mL浓度的胶原与10～40mg/mL浓度的透明质酸按2∶1体积比混合的混合液粘合，形成层状结构；将该层状结构置入无菌密封的包装袋内，加入培养液E，排净袋内空气后密封，再放入压力装置的压力舱内，舱内灌满无菌水排净气泡进行培养，设置流体静压力参数为0.1～2Hz、50～15000kPa；37℃恒温条件下，每天加压2～8小时，培养4～15天，完成组织工程软骨的制备；所述培养液E的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～300μg/mL、Vc为50～200μg/mL、TGF-β₁为3～15ng/mL、bFGF-2为5～20ng/mL和地塞米松1×10^-8～5×10^-6mol/L。