[发明专利]对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及对虾白斑综合症病毒培养技术研究领域，尤其是涉及对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法。

背景技术

对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）是引起对虾白斑综合症的主要病原。于20世纪90年代初首先在中国台北发现，是1993年以来导致我国沿海人工养殖对虾爆发性流行病大规模频繁发生的主要病毒病原。随后在亚洲其他国家以及太平洋海岸国家相继爆发类似疾病。该病毒能使对虾出现各种典型症状，如不喜进食，在池边来回游动，体色变红，对外界反映迟钝，经解剖可见肝胰腺肿大，大多数病虾头胸甲膨大，易被剥离，甲壳上出现明显的白色斑点。

对虾白斑综合症病毒（WSSV）是一种无包涵体的杆状病毒，外面包有一层囊膜，一端有尾状突出，核衣壳为（330-350）nm×（58-67）nm，WSSV的DNA是双链结构。完整的WSSV-中国株有12条主要多肽。通过氨基酸测序和反向遗传学确定WSSV病毒粒子的5种结构蛋白。这5种结构蛋白分别是主要囊膜蛋白VP28和VP19，主要核衣壳蛋白VP26，VP24和VP15。WSSV经口感染和浸泡感染同时存在；对上皮组织和造血组织有较强的嗜性。WSSV宿主范围广泛，世界上所有种类的人工养殖对虾、大部分野生虾蟹类都是WSSV的宿主，在糠虾、白虾、毛虾、螃蟹、桡足类、海葵甚至昆虫体内都有WSSV的检出。在最近20余年来，对虾白斑综合症席卷了全球的对虾养殖地区，给世界对虾养殖也造成了不可估量的损失。高密度的对虾养殖规模，日益恶化的环境和世界性的贸易都加剧了此病的发生与传播。

国内外，对WSSV的病原学、流行病学、诊断学、感染机理等方面的研究早已深入到了分子水平，目前研究热点集中在WSSV结构和功能基因的分析及探明分子水平致病机理。迄今为止已有许多学者对其进行了研究，但诸多问题仍未克服，WSS尚无有效的治疗方法。简单易行的病原繁殖体系是研究的基础。要建立预防和控制白斑综合症病毒感染的有效方法，一个重要的前提条件是要有稳定而纯净的病毒来源，最好的方法就是对其进行体外培养。病毒培养常采用细胞系和鸡胚培养进行。但是目前还没有合适的细胞系来进行WSSV的体外培养，国内外研究者们尝试采用组织、原代细胞培养的方法，这些方法存在着组织、细胞培养技术不成熟、不能传代、成本及实验条件要求较高等问题。目前最主要的WSSV增值模式是采用人工感染动物模型来进行，较成熟的WSSV动物模型主要有克氏原螯虾。虽然克氏原螯虾作为动物模型已经运用得比较成熟，但是由于水域环境复杂，螯虾易感病毒范围广的影响，使得克氏原螯虾存在着带有其他病毒的隐患，此外采用动物模型作为病毒增殖的媒介会受到养殖管理和养殖条件等因素影响。因此要对WSSV进行深入的研究，就必须建立更为稳定、便捷的体外培养方法。

鸡胚培养是一种广泛运用于哺乳动物病毒、禽类病毒等的培养方法，如授权公告号为CN101633911A，公告日为2010年1月27日，发明名称为“适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术中病毒的培养方法”，就采用了9-11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚进行病毒培养，这种培养方法可为规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗提供足够的、合格的禽流感病毒。但是，病毒鸡胚培养多见于一些高等动物病毒的培养，在水生动物病毒领域的研究应用更是鲜见报道。目前，国内外还没有关于利用鸡胚培养方法培养虾病毒包括对虾白斑综合症病毒的方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种首次将鸡胚培养技术应用于对虾白斑综合症病毒的培养，可实现对虾白斑综合症病毒快速、有效的体外传代培养且稳定、便捷的对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，其特征在于：采用SPF鸡胚作为对虾白斑综合症病毒的体外培养体系，选择6-7日龄健康鸡胚，将预先制备除菌了的对虾白斑综合症病毒接种液接种至鸡胚尿囊膜上，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚进行匀浆离心分离，得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。

一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，具体的操作步骤如下：

（1）选取符合SPF规格的新鲜种蛋，气室向上38℃孵化，相对湿度50%，每4小时翻蛋一次，培养6-7天后，选取血管粗大且呈鲜红色的健康发育良好的鸡胚在暗室内画出气室边缘并标明大血管所处位置，以备病毒接种用；