[发明专利]一种鼻咽癌相关易感基因YH1蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.鼻咽癌相关蛋白YH1在与细菌结合和凝集中的应用。

2.鼻咽癌相关蛋白YH1在制备由细菌感染引起的炎症相关疾病中的药物的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，所述鼻咽癌相关蛋白YH1是非融合YH1蛋白。

4.一种鼻咽癌相关蛋白YH1制备方法，其特征是，包括一下步骤：

（1）构建表达载体构建：提取鼻咽组织总RNA，反转录出cDNA；用带有BglII/Xho1双酶切位点的YH1特异性引物进行PCR扩增获得YH1基因，回收产物进行BglII/Xho1酶切；同时pGEX-4T-1载体用BglII/Xho1酶进行双酶切、纯化、回收；回收的YH1基因的双酶切产物连接到pGEX-4T-1载体；连接液转化DH5a大肠杆菌，阳性克隆筛选，得到pGEX-4T-1-YH1表达质粒； 

（2）表达工程菌的构建及诱导表达：将pGEX-4T-1-YH1表达质粒加到冰预冷的E.coli BL21 ( DE3 )感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上孵育25－35 min，40－45℃热激85－95S，立即置冰上2.5－3.5min，加入在37℃预热的500ul无抗LB液体培养基，37℃，震摇45－55min；取菌液涂布在含有Amp抗性LB平板上，放入37℃培养过夜；取单个菌落接种于Amp抗性 LB液体培养基中，37℃震摇培养2.5－3.5h至对数生长期，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为1mM后，37℃震摇培养2－4h，收集培养菌液，离心取上清液，即得所述鼻咽癌相关蛋白YH1。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，还包括纯化和酶切： 

（3）将离心后的上清液重悬于PBS缓冲液中，在冰上以400W的功率超声180－220次，每超声3秒，间隔5秒，然后离心取上清；于Glutathione FF层析柱上进行亲和层析，以1%Triton X-100,1mM EDTA ,pH7.4 PBS 缓冲液洗脱，纯化得到GST-YH1融合蛋白；

（4）将GST-YH1融合蛋白脱盐至pH7.4，PBS 缓冲液中，按照4.5－5.5 unit酶量消化1mgGST-YH1融合蛋白的比例加入Thrombin凝血酶，室温消化1.5－2.5小时；Q Sepharose FF阴离子交换柱进行亲和层析， 10mM GSH,pH8.0 PBS缓冲液GST洗脱下来，再用pH8.0，20mM Tris缓冲液将YH1蛋白洗脱下来,得到非融合YH1蛋白。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述带有BglII/Xho1双酶切位点的YH1特异性引物为： SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。