[发明专利]一种天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种具有抗氧化活性的多肽--天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。在正常生理状态下，机体内自由基的产生与清除处于动态平衡状态，但当机体处于不良环境状态下，以及随着年龄的增长，体内的自由基将会产生过多或清除过慢。自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。

目前，一直公认的自然界生物体中存在着2套抗氧化系统，第一套是蛋白质大分子，比如SOD；第二套为有机小分子，比如Vc、BHT等。化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等，本身具有毒、副作用，各国政府纷纷对其强制规定了ADI值，控制其过量添加。化妆品中常见的抗氧化剂，如维生素C、维生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然虾青素之类的天然抗氧化剂的添加产品，由于其卖点为“天然”，售价普遍过高，难以为大众所接受。

发明内容

本发明的目的是提供一种天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其制备方法和在化妆品中的应用，用中国特有臭蛙的皮肤中存在的天然抗氧化肽替代传统的抗氧化剂，开发新一代天然，极低毒、高效的抗氧化类化妆品。

随着多肽组学和基因组学的发展，本发明在青蛙皮肤中发现了第三套抗氧化系统，其由基因编码的多肽构成，这种多肽多由10-20个氨基酸残基组成。这种天然抗氧化肽是高原地区两栖动物的皮肤对抗紫外损伤有效而强大的武器，对其生存是至关重要的，且其来源天然，低毒、高效的特性，更符合现代人对化妆品的要求。

本发明所获得的天然抗氧化肽来源于中国特有的臭蛙(Odorrana andersonii)的皮肤分泌物。蛙类，是动物从水生生活到陆生生活的重要过渡类型，其皮肤裸露，富含腺体，能分泌大量的活性物质，包括抗菌肽、激肽、镇痛肽等，其中还有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙类动物的“祖先”，因其皮肤在受刺激时能分泌具有刺激性气味的混合物而得名。根据以往工作的经验显示，选取祖先种提取到的有效成分，其活性较强，本发明选用了蛙类的祖先云南臭蛙，且实验结果符合预期的推测。

本发明的天然抗氧化肽Macrotympanain-A1按以下方法制备：

①皮肤分泌物的获取：用6V的电压刺激云南臭蛙的皮肤6s，之后以25mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.8)清洗臭蛙的身体，收集皮肤分泌物，将收集到的分泌物于4000rpm离心15min，将上清液真空冷冻干燥，并储存于-80℃备用；

②多肽的纯化：将冻干的上清液样品重新溶解，上预先用25mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.8，含有0.1M NaCl)平衡好的Sephadex G-75凝胶过滤柱，以0.3ml/min的流速进行洗脱，每10min收集一次。洗脱产物用280nm监测，绘制分离纯化图谱，收集到抗氧化活性成分，并用C₄柱除去里面的盐分后冷冻真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc缓冲液(pH＝4.0)溶解样品，用相同缓冲液平衡好的Resource S分离柱进行纯化，利用含有1M NaCl的同一缓冲液、以1ml/min的流速进行洗脱，洗脱液用215nm波长进行监测，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0.1％(v/v)TFA的超纯水平衡好的HPLC C18分离柱进行分离，利用含有0.1％(v/v)TFA的乙腈以0.7ml/min的流速洗脱，洗脱液在215nm下进行监测，最终获取天然抗氧化肽Macrotympanain-A1纯品。

抗氧化活性评估：样品抗氧化活性的评估反映在其对自由基的清除率上，具体如下：首先配置ABTS储存液：在水溶液溶解2.8mM过硫酸钾和7mM ABTS，避光反应至少6小时，之后，立即用水稀释125倍，50微升溶于水的样品加入50微升ABTS稀释液，避光反应至少10分钟，之后，在415nm波长下读其吸光度，样品抗氧化活性用如下公式进行计算：(A_blank-A_sample)×100/A_blank。

经上述方法制备得到天然抗氧化肽Macrotympanain-A1，其为基因编码产物。N端到C端的序列：FLPGLECVW。活性：0.5ug/ml的浓度下即可清除15％的自由基，2ug/ml的浓度下取出98％的自由基。此外，具有一定的杀菌、免疫调节以及水平衡调节的活性。