[发明专利]一种磷脂酰肌醇的化学制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酰肌醇的化学溶液分离制备方法。

背景技术：

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)为革兰氏阳性无芽孢杆菌李斯特属，是一种重要的人畜共患食源性病原菌，可以引起人和多种动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等，病死率高达30％～70％。由于其具有耐热(60℃)、耐低温(4℃)、耐盐、耐干燥等特性，因此潜在危害很大，是食品安全风险评估所关注的重要食源性致病菌之一。1986年，WHO和FDA将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一；2000年，LM被WHO列为重点检测的食源性致病菌之一；国际食品法典委员于2009年开始使用食品中LM的限量标准。第51届世界卫生大会之后，我国开始逐步研究通过实施微生物学危险性评价(MRA)和危害性分析关键控制点(HACCP)等原理来加强对微生物性有害因素的有效管理。2009年JEMRA及美国FDA/FSIS分别对即食食品中LM进行定量评估并发布了评估报告。

近年来LM作为食品卫生及流行病学的研究热点，其分离和鉴定方法取得了很大的进步。LM的检测时间、特异性、灵敏度以及准确性等各方面都得到很大的改进。目前主要应用的方法有如下三类：传统的培养方法、免疫学方法以及分子生物学检测方法。

针对LM的快速检测的需要，许多国家致力于LM显色培养基的研究，针对LM特有的肌醇磷酸磷脂酶(PI-PLC)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glueosidase)设计显色底物对LM进行快速检测。商品化的显色培养基主要有以下几种：以七叶灵为底物的PALCAM、OXFORD、LPM、MOX培养基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和肌醇磷酸X-IP为底物的BCMIII listeria显色培养基；以X-IP为底物的Rapid’LMONO agar培养基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和磷脂酰基醇为底物的CHROMagar Listeria显色培养基、ALOA培养基以及OCLA培养基。其中部分显色培养基已经得到大规模的商品化。而国内关于LM显色培养基的研究一直处于滞后状态，主要是由于底物价格昂贵，难以大规模开发应用。因此LM显色底物的制备研究成为制约LM显色培养基应用的关键技术，是目前研究的难点。

国内外相关研究表明磷脂酰肌醇(l-α-phosphatidylinositol)能够作用于LM中的特异性磷脂酶PI-PLC，可以作为特异性检测底物应用于LM显色培养基。

磷脂酰肌醇的主要分离制备方法有溶剂法、柱层析法、薄层色谱法、酶法和化学反应法等。其中溶剂法操作简便，便于工业化，但是具有消耗溶剂量大，生产成本高的缺点；柱层析法分离效率高，但负载量小，可重复性差；薄层色谱制备量小，分离能力有限，主要用于检测；化学反应方法合成容易使得肌醇磷脂中不饱和键着色且副产物难以有效分离；另外还有利用高效液相色谱制备少量磷脂酰肌醇纯品，但是由于成本高操作复杂且产量很少，只停留在实验室少量分析研究的阶段。

目前国内的磷脂酰肌醇制备产率提高困难，难以商品化应用；国外引进又价格昂贵，从而限制了磷脂酰肌醇在微生物检测等方面的应用，亟需寻找一种高产率且商品化可行的制备工艺。在国内大豆磷脂酰肌醇的研究比较少，迄今为止主要有齐齐哈尔大学以及武汉工程学院做过相关方面的研究。齐齐哈尔大学在2003年到2006年做了用溶剂法分离制备大豆肌醇磷脂相关方面的研究，其中2005年陈志强等报道了可以采用乙醇-正己烷体系分离了肌醇磷脂，2006年吴平等进一步考察了溶剂法分离磷脂酰肌醇的优化条件，并称可以将产率提高到73.89％；2008年后武汉工业学院做了采用柱层析法分离制备大豆磷脂的研究，2008年以及2009年姜波等报道了用柱色谱法分离制备大豆磷脂，实验表明硅胶为吸附介质分离大豆磷脂是可行的，但是由于柱层析法负载量较小，且分离周期长，所得产量较低而一直没有得到实际应用。目前亟待开发一种简便有效的分离方法，得到便于工业化的优化工艺条件，使磷脂酰肌醇的制备工业化，为其在显色培养基中的应用创造条件。而国外相关研究集中在上世纪九十年代，目前已经发展到工业化应用领域。目前国外采用的获得大豆肌醇磷脂的方法主要为酶法及分子改性等化学手段。

发明内容：

本发明的目的是提供一种磷脂酰肌醇的化学制备方法，该方法简单易行，大大降低了生产成本，便于工业化生产。利用该方法制备得到的磷脂酰肌醇产品的纯度高，经实验证实可以作为进口原料的替代品作为底物应用到LM显色培养基中，效果很好。