[发明专利]一种疟疾疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及疟疾疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。 

背景技术

据世界卫生组织统计，全球大约有3.2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约100万人的性命并导致4亿人感染，而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和血液传播等新的传播方式的出现使得疟疾疫情的控制面临更加严峻的挑战。每年感染疟疾致死的人群中，92%为五岁以下的儿童。因而疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。 

疟原虫生活史有多个时期，每个生活时期具有多种抗原，而且每种抗原具有多个表位，而不同宿主的免疫反应也不相同，所有的这些因素使得疟疾疫苗的研究变得异常困难。传统的疟疾治疗主要依赖于药物治疗，氯喹是一种使用方便、疗效好且经济的红内期抗疟药物，氯喹可以与恶性疟原虫体内的血红蛋白降解产物高铁血红素结合从而影响恶性疟原虫的解毒，来达到杀灭疟原虫的目的。任何一种药物经过长时间的使用之后都会使其作用受体对其产生一定的耐受性，由于药剂量不足、治疗不彻底、药物半衰期长、疟疾传播密度高等都有可能致使恶性疟原虫对氯喹产生抗性，因此药物疗措施已面临着严重的挑战。 

疟疾的临床症状主要发生在疟原虫裂殖子孢子在人体红细胞内无性增殖阶段，目前疟疾疫苗研究的热点主要是基于阻止此阶段疟原虫的无性裂殖来预防疟疾的感染。裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP1_19C)在子孢子侵染红细胞后仍然存在于裂殖子表面，可诱导机体T细胞和B细胞产生免疫应答，因此是当前最重要的疟疾疫苗研制的候选抗原位点之一。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的疟疾疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP1_19C)展示在家蚕杆状病毒表面MSP1_19C基因通过与GP64基因的跨膜(TM)基因与信号肽(SP)基因相连，通过信号肽(SP)基因的引导和跨膜(TM)基因的锚定，在病毒表达和复制过程中将MSP1_19C蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原进行生产，相比于传统疟疾疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。 

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下： 

一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5602。

上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c的制备方法，包括以下步骤： 

(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过BamHI/EcoR I和XhoI/HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；

(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因MSP1_19c序列，其5’和3’端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19C；

(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19C转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40h~48h后挑取白斑，培养20h~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物、MSP1_19c引物做PCR鉴定；