[发明专利]侧孢短芽孢杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有不多于15个氨基酸的端部具有修饰的肽段。

背景技术

抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子多肽，广泛存在于生物体内，具有分子量小、生物活性稳定、作用机制独特、不易产生耐药性等特点，对病原真菌与细菌具有强烈的抑制及杀灭作用。申请人从侧孢短芽孢杆菌中挖掘新结构的抗菌肽，不仅可以提供宝贵的抗菌资源，而且为侧孢短芽孢杆菌的开发利用开辟了新的途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能抑制病原真菌和细菌生长的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)抗菌肽及其应用。

本发明所述的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)A60菌株已经于2012年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号CGMCC No：5694，分类命名为：侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。

一种侧孢短芽孢抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，该氨基酸序列的N端上还连接有-(CH₂)₃N(CH₃)₂，该氨基酸序列的C端上连接有细交链孢菌酮酸衍生物，该细交链孢菌酮酸衍生物的结构式如下所示：

本发明还涉及该侧孢短芽孢杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用。

本发明侧孢短芽孢杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用，其中所述病原真菌为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae)。

本发明还涉及该侧孢短芽孢杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用。

本发明侧孢短芽孢杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用，其中所述细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、番茄疮痂病菌(XanthomonasCampestrispv.Vesicatoria)、普通变形杆菌(Prototheca wickerhamii.)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

本发明侧孢短芽孢抗菌肽的制备过程包括以下步骤：

1、侧孢短芽孢杆菌A60培养及发酵代谢液制备

挑取活化单菌落于LB培养基中培养，培养条件为28℃、180rpm培养大于48h，离心去除菌体细胞，上清液用于抗菌肽分离；

2、抗菌代谢物的提取

(1)80％硫酸铵沉淀

对所得上清液进行硫酸铵沉淀，使硫酸铵达到80％饱和度，4℃过夜，离心收集沉淀，透析除盐得到侧孢短芽孢杆菌粗提物；

(2)离子交换层析分离：

用阳离子交换层析分离侧孢短芽孢杆菌粗提物，层析柱为HiTrap SP HP阳离子柱(GE)，平衡液为20mM的MES(pH6.2)，洗脱液为20mM的MES(pH6.2)与1M NaCl，流速2.5ml/min。线性洗脱，收集第二洗脱峰组分；

(3)薄层层析分离

用薄层硅胶层析板对第二洗脱峰进行薄层层析，展开剂为异丙醇∶正丁醇∶氨水∶水，其体积比例为60∶20∶10∶20，展开时间约2小时，获得4个组分；

(4)反相层析纯化

收集薄层层析中离溶剂前沿最近的组分，将其用乙腈溶解，进行反相层析，反相层析的具体条件如下：柱子采用Waters Atlantis T3-C18柱，直径2.1mm、柱长150mm、粒径3.5μm，进样体积为200ul，平衡缓冲液为含有1％三氟乙酸的超纯水，洗脱缓冲液为100％乙腈，收集第13-14.5分钟洗脱的组分；

(5)二次反相层析纯化

将步骤(4)收集的组分再次进行反相层析，层析具体条件同步骤(4)，收集第14-14.5分钟洗脱的组分，即得。