[发明专利]小鼠醛氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠含钼酶醛氧化酶转录水平进行定量用PCR引物组合，同时还涉及一种使用该引物的实时荧光定量PCR方法，属于生物检测技术。

背景技术

醛氧化酶(aldehyde oxldases.AOX)是一类催化醛类氧化成相应的羧酸并释放出活性氧的蛋白酶，主要存在于肝脏和红血球中。它属于钼-黄素酶(molybdo.flavorenzyme.MFE)家族的亚家族，是新陈代谢不可缺少的酶类。它参与多种生理调节，可以将体内形成的有毒醛氧化为无毒酸，以缓解醛类对机体的毒害作用，也参与细胞内电子传递，在与代谢和繁殖相关的生理活动中起着非常重要的作用。其转录水平的高低反映了机体代谢的状态。

以往的对醛氧化酶的研究主要集中在该酶的序列、结构和功能上，其中RalfR.Mendel在Biochimica et Biophysica Acta 1763(2006)621-635发表论文Cell biology of molybdenum就醛氧化酶的结构和功能等做了综述，而对于醛氧化酶转录水平研究上缺乏有效的工具。

而实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量。实时荧光定量PCR可以对极微量的DNA模板进行准确定量，因其精度高，时间短而被广泛的应用。目前国内外还未见对醛氧化酶转录水平定量方法的研究。

为了研究小鼠体内醛氧化酶的转录水平，需要建立一种能够精确对醛氧化酶mRNA定量的方法，进而为研究醛氧化酶功能及其影响因素打下基础。

发明内容

本发明的目的提供了一种醛氧化酶转录水平定量用PCR引物组合在转录水平上对醛氧化酶进行定量。

同时，本发明的目的还在于提供了一种能够实时荧光定量的PCR方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物，其核苷酸序列为：

正向：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’

反向：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’。

本发明的技术方案还采用了一种醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，该方法以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量醛氧化酶转录水平。

扩增序列为：actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。

所述的实时荧光定量PCR扩增体系为：25μL体系2×SYBR Mix 12.5μL，10μmol/L正向；反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，9.35μL去离子水，TaqDNAPolymerase 0.15μL，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。

所述的三步法为95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃31sec，40个循环。

本发明通过分析小鼠醛氧化酶基因序列，设计特异引物，能够快速、精确的对醛氧化酶转录水平定量。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得。引物序列是在充分分析醛氧化酶基因序列的基础上，因此对材料中非目的基因没有扩增信号。通过使用本发明的引物，对小鼠的醛氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，本发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。

实时荧光定量PCR25μL体系(2×SYBR Mix 12.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，9.35μL去离子水，TaqDNA Polymerase 0.15μL)，三步法(95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃31sec，40个循环)对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。扩增结果可以通过与看家基因(如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等)比较，从而确定醛氧化酶的转录水平。计算公式如下：

醛氧化酶基因转录水平＝2^-ΔCT