[发明专利]在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在制备抗毒素、抗血清过程中同时灭活病毒的方法，属于生物技术领域。

背景技术

抗毒素、抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体(IgG)或抗体片段[F(ab’)₂]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。

由于抗毒素、抗血清原料来源于马匹，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除要控制免疫马匹饲养环境和原料血浆质量外，在抗毒素、抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的关键问题。

目前国内外较为成熟的病毒灭活/去除方法有：巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产的抗毒素、抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。

巴氏消毒法和干热法属热力处理灭活病毒方法，即通过热力使病毒蛋白变性，以破坏病毒结构从而灭活病毒，但同时热力也存在会使蛋白制品变性或生物活性降低的问题，故采用上述两种方法灭活病毒时，常需在蛋白制品中加入保护剂，但同时保护剂在保护蛋白制品的同时也保护了病毒，降低了病毒灭活率，从而加大了病毒灭活的难度。纳米膜过滤法主要利用病毒颗粒与蛋白分子的大小差异，通过纳米级的滤膜把病毒除去，但只适于小分子（直径较小）的蛋白制品，不适于大分子（较大直径）的蛋白制品，且纳米膜价格昂贵。光化学法是利用某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构具有强烈的亲和作用，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构的方法，但该方法对一些蛋白活性损伤较大。

有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微，但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。

发明内容

针对现有生物制品中病毒灭活或去除存在的操作时间长，容易造成活性物质失活，病毒灭活不彻底，适用范围受限等不足，本发明提供一种简单、快速、经济、适用范围广的，能在制备抗毒素、抗血清过程中，同时灭活存在于血液中的病毒的方法，以保证抗毒素、抗血清制品能够更安全有效地应用于临床。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种在制备抗毒素、抗血清中灭活病毒的方法，其特征在于包括下列步骤：

A、将血浆原料稀释２～４倍体积后，调节稀释液pH值至2.8～4.0；

B、在每100ml步骤A的稀释液中，加入0.1～1.0g胃酶，于29～31℃下消化１～3小时，或者于20～22℃下消化20～22小时，得消化液；

C、在每100ml步骤B的消化液中，加入14～16ｇ硫酸铵，并调节混合液pH值至4.8～5.6，加热混合液至57～59℃，并保持30分钟，降温至45℃以下，分离，得上清液；

D、将步骤C的上清液稀释至所含蛋白浓度为10～50 g/L，在该稀释液中加入有机溶剂和去污剂，直至每100ml稀释液中含有0.25～1.35g的有机溶剂，每100ml稀释液中含有1.00～1.35g的去污剂，于24～37℃水浴中恒温4～6小时，得混合液；

E、在每100ml步骤D的混合液中，加入15～25 g硫酸铵，静置90～180分钟，分离去上清液，得沉淀物；

F、将步骤E的沉淀物稀释至蛋白含量低于20 g/L，调整稀释液pH值为7.7～7.9，并按每100ml稀释液加入0.6～1.0g明矾的量，在稀释液中加入明矾，静置60～120分钟后，过滤得上清液；

G、将步骤F的上清液用3～5万分子量的滤膜，浓缩至五分之一体积时，在浓缩液中加入20mM、pH值为6.0～8.0、加入量是步骤A的原料血浆体积的2～5倍的PB进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0 g/L，得浓缩液；

H、将步骤F的浓缩液，经离子交换层析后，得收集液，按常规对收集液进行除菌、过滤后，分装得灭活病毒的抗毒素、抗血清制品。

所述步骤A、D、F的稀释是采用注射用水或者质量浓度为0.8～1.0%的NaCL溶液进行稀释的。