[发明专利]一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法

权利要求书

1.一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤如下：

（1） 细菌总DNA的提取：提取水产养殖生物或水产养殖环境样品里细菌总DNA；

（2） 以步骤（1）所得总DNA为模板，SEQ ID NO:1~2所示序列为引物， PCR扩增和分析16S rDNA序列，进行测序，鉴定菌株的种属名称；

（3）经过种属鉴定的菌株进一步测序鉴定，检测带有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因为耐氯霉素基因floR、耐磺胺类基因sul1，和/或耐磺胺类基因sul2。

2.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（1）细菌总DNA的提取具体操作如下：

（1）将分离纯化的细菌接种于2216E液体培养基或LB液体培养基中，28℃隔夜摇床培养；

（2）吸取经过培养的菌液，7500rpm离心5min，弃上清液；

（3）沉淀加入无菌水，振荡摇匀后，沸水煮10min；

（4）12000rpm离心10min，上清液即可作为DNA模板。

3.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR反应体系为50μL，内含2×PCR Reaction Mix 25μL、2.5U的Taq酶0.5μL、10μM的引物SEQ ID NO:1和引物 SEQ ID NO:2各2μL、含50～150ng的DNA模板溶液2μL、ddH₂O 18.5μL。

4.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最后在72℃充分延伸10min。

5.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增16S rDNA产物大小为1.5Kbp。

6.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（3）中检测抗生素抗性基因的PCR反应体系为20μL，其中2×PCR Reaction Mix 10μL、2.5U 的Taq酶0.2μL、10μM的上下游引物各0.8μL、含50～150ng的DNA模板溶液1μL，ddH₂O7.2μL。

7.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐氯霉素基因floR使用的引物序列为SEQ ID NO:3~4。

8.根据权利要求7所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐氯霉素基因floR的条件为：95 ℃预变性5min，然后98℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后在72℃充分延伸5min。

9.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐磺胺类基因sul1使用的引物序列为SEQ ID NO:5~6；

扩增耐磺胺类基因sul2使用的引物序列为SEQ ID NO:7~8。

10.根据权利要求9所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐磺胺类基因sul1或sul2的条件为：95 ℃预变性5min，然后98 ℃变性15s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后在72℃充分延伸7min。