[发明专利]一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从丹参药材中分离纯化得到纯度大于98.0％的丹酚酸B的制备方法。

技术背景

丹参为唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效。丹参主要含两类有效成分：一为脂溶性的二萜类化合物，二为水溶性的多聚酚酸类成分。实验研究证明，丹参水溶性成分具有多方面的药理活性，具有很强的抗氧化活性。丹酚酸B为丹参中重要的水溶性有效成分之一，约占总酚酸的70％，在2010版中国药典中，已将丹酚酸B作为丹参片的指标成分。丹酚酸B由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，研究表明其有强烈的抗氧化和清除氧自由基的活性，对肾功能不全和肝损伤均有一定保护作用。分离制备丹参水溶性活性成分对进一步揭示丹参药效的物质基础和开发新的天然药物具有十分重要的意义。而丹酚酸B在水溶液中的稳定性与pH值、温度有很大关系，给中药制剂的生产和储存带来较大的困难。

目前丹酚酸B的分离纯化方法主要有：(1)柱层析法，但操作比较复杂，效率不高，而且需要不同填料结合使用；(2)制备型高效液相色谱法，对设备和试剂要求高，成本较高，难以规模化生产；(3)高速逆流色谱法，需要进行大量实验选择合适的溶剂系统。

快速制备色谱是在传统柱色谱的基础上发展起来的快速分离系统，采用自动输液系统和更小粒径的填料，通过连接检测器进行实时监测，并可自动收集馏分。该色谱仪可使用分析纯试剂做流动相，降低了成本，可承受较高流速，通过调节流动相的比例实现对物质的快速、有效分离，并且重复性好。

丹酚酸B的结构式如下：

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度＞98.0％)的丹酚酸B分离制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种快速制备色谱分离制备丹酚酸B的方法：丹参药材先用含乙醇水溶液超声提取，减压浓缩，经有机溶剂萃取得到浸膏，以浸膏为原料，以快速制备色谱为分离手段，以甲醇-水为洗脱体系，具体步骤为：

(1)药材处理：丹参药材以1∶10～20的料液比(m/v)，用体积分数30％～80％的乙醇-水溶液，超声提取0.5～2h，过滤，滤渣同法再提取1次，合并两次的提取液，滤过，合并滤液，滤液60℃以下减压浓缩至为原体积的1/2～1/4，过滤，滤液用乙醚萃取，乙醚用量与浓缩液体积比为0.5～1，水层加酸调节pH为3～4，过滤获得水层清液，水层清液以乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；

(2)样品处理：乙酸乙酯浸膏加体积分数10％～70％的甲醇-水溶解，得浓度为30～60mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清，得到样品溶液；

(3)色谱柱预处理：快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，以洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为25％～50％；

(4)进样：将步骤(2)获得的样品溶液进样，进样体积为1～5mL；

(5)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在3～5mL·min^-1，收集洗脱液；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积分数为25％～50％；

(6)丹酚酸B的获取：收集的洗脱液(加入氯化钠固体至)饱和后，乙酸乙酯萃取，经减压浓缩和干燥得到丹酚酸B固体。

优选步骤(1)所述的乙醚萃取次数为1～3次，优选3次，每次乙醚的用量与浓缩液的体积比为1∶0.5～1，优选等体积；水层采用0.1～1mol·L^-1盐酸溶液调pH为3～4；乙酸乙酯萃取次数为1～3次，优选3次，每次乙酸乙酯的用量与水层清液体积比为1∶0.5～1，优选等体积。

其中，步骤(3)是以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。所采用的制备型中低压色谱柱可以为商品化或手工填充的中低压色谱柱，填料为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm。

优选步骤(5)的洗脱过程采用在线紫外检测，自动收集洗脱液，紫外检测波长为254nm和286nm。

步骤(6)所得洗脱液用氯化钠饱和，所述乙酸乙酯萃取，次数优选为3次，合并乙酸乙酯层，经减压浓缩和真空干燥丹酚酸B；减压浓缩和真空干燥的温度为30℃～60℃，优选30℃～35℃。

可以采用以下优选方案进行制备：