[发明专利]一种新的基因定量方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及一种新的基因定量方法。

[背景技术]

包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)等技术的基因扩增技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA或者RNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA或RNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。

由于基因扩增技术的高灵敏性导致会出现一些假阳性，基因定量技术应运而生，常见的定量技术包括荧光定量PCR技术，LAMP的实时浊度定量技术等，这些技术的出现为基因扩增技术的应用带来了更为广阔的前景。目前我国临床已经抛弃了普通的基因扩增定性检测，全部采用定量基因扩增技术。但是这些定量技术都需要大型的仪器设备，一台定量PCR仪的价格是普通PCR仪价格的十多倍，因此只能够在大医院和科研院所展开相关检测和研究，基层医院和偏远地区无法享受这一高科技产品带来的福音。

因此特别需要一种简单而且不需要大型设备的基因定量技术。

[发明内容]

本发明的目的是在于解决现有技术的不足之处而提供一种提供一种鉴定结果直观、操作简单、特异性好、适合基层的基因定量技术。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：(1)通过实验鉴定出一组扩增试剂在相同条件下的灵敏度，即可以检测到的最低基因数量；(2)将待定量的模板稀释不同倍数，然后对不同浓度的模板用同一组扩增试剂进行基因扩增；(3)通过能够实现基因扩增的最大稀释倍数计算待定量的基因数量。

一组检测时间在相同的检测条件下，能够检测到的最低基因数量，即该组检测试剂的检测灵敏度。一组试剂的检测灵敏度是一个恒定的数值，具有很强的可重复性。我们可以通过实验室条件进行基因定量，等比稀释等方法鉴定一组基因扩增试剂的检测灵敏度。

将待定量的模板进行逐级稀释，用同一组扩增试剂对各稀释比例的模板进行基因扩增，大于该组扩增试剂灵敏度浓度的稀释管可以完成扩增反应，低于该组扩增试剂灵敏度的稀释管不会完成扩增反应。用该组扩增试剂的灵敏度乘以可以完成扩增反应的最大稀释倍数就是带定量的模板数量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的一种新的基因定量方法只需要原有的基因扩增设备，像LAMP和NASBA技术只需要一个恒温环境即可，不需要额外的实验设备，大大简化了设备投入，成本投入低，适合基层和现场使用。2.本发明的一种新的基因定量方法计算简单，只是应用了一个乘法计算，简洁明了，易懂易用。3.本发明的一种新的基因定量方法省去了荧光定量PCR所需要的荧光剂、探针等物质，成本更低。4.本发明的一种新的基因定量方法具有广泛的适用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等现有的基因扩增技术结合，完成定量过程。

[具体实施方式]

为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施。

本实施例采用LAMP技术定量检测大肠杆菌。

实施例1

(1)按以下序列合成大肠杆菌寡聚脱氧核酸引物：

ECFL：CTTCGCCACCGGTATTCC

ECBL：GGATTAGATACCCTGGTAGTCC

ECBIP：GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGACCTCCAAGTCGACATCGTT

ECFIP：TCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC

ECB3：CGTTAGCTCCGGAAGCCA

ECF3：TCTCGTAGAGGGGGGTAGA

(2)制备工艺如下：

将Bst DNA聚合酶10单位/管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/LKCl、50mmol/L MgSO4、0.5体积％TritonX-100、1mmol/L甜菜碱、1mol/L HNB，内引物FIP/BIP1.6ummol/L、外引物F3/B30.2ummol/L、环引物LB/LP 0.4ummol/L。

以上物质溶于20ul水中。

(3)灵敏度的检测和未知浓度的定量检测：

a.取冷藏的HB101大肠杆菌菌液在LB培养基上划线分离单菌株。挑单菌落接种至10ml液体LB培养基继续培养过夜，裂解法抽提大肠杆菌基因组DNA。