[发明专利]一种用于丝状真菌显微形态观察的制片方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌学研究领域，具体涉及一种用于丝状真菌显微形态观察的制片方法。

背景技术

长期以来，对丝状真菌的生物学鉴定主要是以菌体的形态特征为依据，因此，获得较好的菌体显微形态观察玻片对于准确鉴别丝状真菌种类就至关重要。目前，制作丝状真菌观察玻片的传统方法的步骤如下：首先用挑针直接挑取培养基上的真菌培养物，置于载玻片上；然后小心地将挑取的菌丝体用挑针分散开，盖上盖玻片。但此方法存在以下几个明显的缺点：(1)由于传统制片方法极易出现菌体重叠，难以获得观察效果较好的玻片，即使技术娴熟的操作人员也需要大量制片，才能获得符合观察要求的观察玻片；(2)在挑片过程中，真菌孢子在载孢体上的自然着生状态极易遭到人为破坏，因此，传统挑片法获得的观察玻片往往难以反映真菌的产孢方式与类型，而此项特征正是丝状真菌分类中最为关键的鉴别要素；(3)挑片获得的观察玻片中，菌体往往处于发育后期，通过挑片的方法几乎不可能获得发育早期的菌体，这对研究真菌不同发育阶段菌体形态特征十分不利。因此，在丝状真菌鉴定领域就需要建立一种新的制片方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于丝状真菌显微形态观察的制片方法，即针对传统制片方法的严重缺陷而建立的一种新的制片方法，便于更加全面、精确地观察丝状真菌的显微形态特征，以保证菌种鉴定工作的准确性，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，其步骤如下：首先在水琼脂培养平板上挖取一个凹槽，移除凹槽内的培养基；再将一块尺寸小于凹槽的水琼脂培养基块放置在凹槽内，挑取待鉴定真菌培养物接种于位于凹槽内的水琼脂培养基块朝上的一面，然后将无菌盖玻片盖于水琼脂培养基块上；盖上培养皿盖，密封后于室温下培养，培养结束后取出盖玻片，制作成真菌的观察玻片。

上述的水琼脂培养平板的制备方法如下：在1000ml蒸馏水中加入15克琼脂粉后，121℃，98.1kPa灭菌，最后倒入无菌培养皿中冷却。

上述的凹槽为方形，其大小为1.6×1.6cm²。

上述的水琼脂培养基块的大小为0.4×0.4cm²。

上述的无菌盖玻片大小为1.8×1.8cm²。

本发明的方法制作丝状真菌的菌体观察玻片简单易操作，可以根据不同菌种的生长周期，采用连续取片的方式，获得不同发育时期的菌体观察玻片，保证了丝状真菌物种鉴定工作的准确性。

具体实施方式

本发明的更具体的实施步骤：

(1)配制水琼脂培养基，高压灭菌(121℃，98.1kPa)后倒入已灭菌的培养皿(直径9cm)中，每皿约20ml，待其自然凝固后，用解剖刀在培养平板上挖取3-4个1.6×1.6cm的方形凹槽，移除凹槽内的培养基；

(2)移除凹槽内培养基之前，用解剖刀切取0.4×0.4cm的水琼脂培养基块，并放置于凹槽中心位置；

(3)将培养了一定时期的待鉴定真菌培养物用挑针挑取少许接种于位于方形凹槽中心的0.4×0.4cm的水琼脂培养基块朝上的一面；

(4)将已灭菌的大小为1.8×1.8cm的盖玻片盖于其上，并使得凹槽中心的培养基块位于盖玻片中央，然后盖上培养皿盖并密封，于室温下培养；

(5)根据不同种类丝状真菌的生长特点，在培养的第3天，第6天，第10天和第15天，分别取出1-2片盖玻片，选用合适的浮载剂，制作观察玻片，即可用于观察不同发育时期的菌体形态特征。上述实施步骤的(1)-(4)需要在超净台中完成。

通过显微镜观察，本发明方法制备的丝状真菌显微形态的盖玻片上的菌体处于自然生长状态，很少出现菌体重叠现象，更为重要的是，由于菌体的自然生长状态未受破坏，制作的观察玻片利于形态特征(如产孢方式和类型)的显微观察。通过采用在不同培养时间取出盖玻片的方式制作观察玻片，实现了对菌体生长发育状况的连续观察，可以获得全面反映菌体不同发育时期形态特征的观察玻片，从而掌握包括丝状真菌产孢方式和孢子形成的动态变化过程，有利于对真菌物种进行准确鉴定。