[发明专利]短RNA分子

说明书

技术领域

本发明涉及生成能够生产胰岛素的细胞的方法。该方法包括使用能够增加MafA的表达的短RNA分子。本发明还涉及到这种短RNA分子和它们在治疗中的应用。

背景技术

糖尿病影响全球至少2亿人。当身体无法生产足够量的胰岛素（调节血液中葡萄糖水平的激素）时就会出现糖尿病。在健康个体中，胰岛素是由胰腺，更具体是由胰腺β细胞生成的。I型糖尿病通常是由免疫系统的T-细胞破坏胰腺的β-细胞造成的，因此自身免疫紊乱通常是根本原因，虽然感染、尤其是病毒感染，或者伤害也能够引起胰腺β-细胞的破坏或紊乱。这将导致胰岛素产量的严重匮乏。

目前的治疗选择主要依靠施用外源性胰岛素。其缺点包括对病人的不便，并且该种方法难以微调，通常会导致在某些情况下胰岛素过量，在其他时候胰岛素过少。

世界各地的I型糖尿病的发病率逐渐增加，相伴的，在这些患者中维持活性胰岛素分泌的稳定来源的临床挑战，使得向寻找实现这一目的的其他机制中投入了相当多的努力。然而，目前尝试的再生胰岛细胞或移植胰岛细胞并不完全有效，因此对于产生胰岛素生成细胞仍然存有需要。

能够从增加胰岛素产量中获益的其他疾病包括II型糖尿病、脂肪肝、肥胖症（尤其是病态肥胖症）以及与葡萄糖和/或胰岛素生成、摄取和/或利用缺陷相关的任何其他疾病。

胰腺由两个隔室，外分泌及内分泌隔室组成，每一个具有不同的功能。内分泌隔室由朗格汉斯小岛组成，所述朗格汉斯小岛由合成肽激素胰岛素(β-细胞)、胰高血糖素（α-细胞）、促生长素抑制素（δ-细胞）和胰多肽（γ-细胞）的四种细胞类型簇组成。这些细胞已被证明在胚胎发育过程中从导管上皮干细胞通过连续分化而进行分化。胰腺源于前肠内胚层的背侧及腹侧区域的不同的胚胎分支，这些分支生成了内分泌及外分泌细胞（13）。最早已知的胰腺标志物的表达包括Hlxb9和PDX1同源异型框蛋白。这些转录因子对胰腺特异性的主信号发生响应并在形态发生前指示胰腺干细胞。PDX1对于胰腺上皮的形态发生和分化是必要的。胰高血糖素和胰岛素表达开始于下游的蕾状期。PDX1还会生成神经原素3(Ngn3)阳性细胞作为内分泌世系的起源。随后Ngn3的激活启动了其他转录因子包括NeuroD1、Rfx6和MafA的表达，继而引导细胞分化成为成熟的胰岛细胞（20，21）。乙胞素过表达已被证明会诱导胰岛素分泌。

胰岛素原在内质网中合成，在内质网中其被折叠并且其二硫键被氧化。胰岛素原继而被运送至高尔基体，在该处被包装进入分泌囊泡，在分泌囊泡中经过一系列蛋白酶的处理，形成成熟的胰岛素。成熟的胰岛素少了35个氨基酸；4个被完全切除，剩余的31个形成了C-肽。C-肽从胰岛素原序列的中心分离出来；两个其他端部（B链和A链）通过二硫键保持连接。因此，胰岛素原和胰岛素是由相同基因编码的，所以本说明书中“胰岛素”基因的任何引用都应该被理解为指的是编码胰岛素原的基因，以及对“胰岛素原”基因的任何引用均应该理解为指的是编码最终成为胰岛素的蛋白的基因。

本发明的发明人已经着手开发一种优选以葡萄糖响应的方式上调靶基因以生成能够生产胰岛素的细胞的方法。这些细胞，即生产或能够生产胰岛素的细胞在本说明书中有时会被称为“特化的”细胞。本说明书中对于“特化的细胞”的任何引用优选为“生产/能够生产胰岛素的细胞”。

目前上调感兴趣的基因表达的方法要求向细胞中引入额外拷贝的基因，可以通过使用病毒以将额外拷贝的基因引入到宿主基因组，也可以通过引入表达额外拷贝靶基因的质粒。因此，为了上调，目前需要将表达载体侵入性瞬时转染或稳定的病毒转导进入细胞中，这引起了安全上的问题。目前的方法通常涉及非瞬时应用上调试剂。这些方法的限制是效果是相类似地非瞬时的。

RNA干扰(RNAi)是一种重要的基因调节机制，会引起靶mRNA的序列特异性下调。RNAi通过“干扰RNA”(iRNA)介导；这是一个总称，包括多种在RNAi过程中发挥作用的短的双链RNA(dsRNA)分子。

外源性dsRNA可以通过核糖核酸酶蛋白Dicer处理成19-25个碱基对，优选为21-23个碱基对的双链片段，在每个3'末端有几个未配对的碱基形成3'突出。优选地，每个3'突出为1-3个，更优选为2个核苷酸长度。这些短的双链片段称为小干扰RNA(siRNA)，这些分子使得靶基因的表达下调。