[发明专利]脂质化多肽的制造方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请依据2010年11月15日美国第61/413,588号专利临时申请案，其相关内容已纳入供参考。

背景技术

将具有脂质的膜蛋白进行转译后修饰作用(Post-translational modification)，似乎是原核细胞特有的。细菌脂蛋白共有其具有一段位于剪切部位，已知称为脂质区框(lipobox，即[LVI][ASTVI][GAS]C)的连续序列的共通结构特征。参见，例如，von Heijne,Protein Eng2:531-534(1989)。它们的N-端一旦经过脂质部分修饰后，就会将其定锚在细胞表面上，并作用为结构性蛋白(例如，胞壁质蛋白)或催化性蛋白(例如，胞膜结合酵素或运输蛋白)。参见，例如，Hayashi与Wu,J Bioenerg Biomembr22:451-471(1990)。已使用Braun氏脂蛋白详细研究大肠杆菌中的脂蛋白生物合成作用。参见，例如，Braun与Rehn,Eur J Biochem10:426-438(1969)。该蛋白首先以未经修饰的原脂蛋白(prolipoprotein)形式被合成，然后再由原脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)进行修饰。Lgt催化该二酰基甘油基部分从磷脂酰基甘油转移到固有半胱胺酸的硫醇基。接着藉由原脂蛋白讯号肽酶(LspA)，将二酰基甘油基原脂蛋白位于该经修饰半胱胺酸的脂质化讯号序列裂解。再由磷脂质-去脂脂蛋白N-酰基转移酶(Lnt)催化最终的修饰作用，其将脂肪酸加至N-端半胱胺酸而形成该成熟的脂蛋白。

由于大多数脂蛋白位于细菌的细胞表面上，它们很容易暴露至宿主的免疫系统。脂蛋白中与半胱胺酸连结的二酰基脂质部分，被免疫系统辨识为一种危险的讯号。因此脂蛋白对于保护性免疫作用而言是重要的抗原。重组脂蛋白作为疫苗候选者的应用，已受限于重组脂蛋白的表现量、脂质修饰作用及后续的处理。因此，有需要一种表现脂蛋白的改良方法。

发明内容

本发明基于意外发现，一种培养基组成物能影响培养于该培养基中的大肠杆菌表现脂质化重组蛋白质。

于是，本发明描述一种于大肠杆菌制造脂质化重组多肽的方法。该方法包括：提供一种经适应表现重组脂质化多肽的大肠杆菌宿主细胞；以及将该大肠杆菌宿主细胞在能表现呈脂质化形式的多肽的条件下，培养于基本培养基(minimal medium)中，其中该经前述方法表现的重组脂质化多肽的未成熟对成熟脂蛋白的比例(I/M比例)为3.9或以下。例如，该I/M比例可为0.1或以下、为0.01或以下或是0.001或以下。

于有些具体实施例，该基本培养基可为M9培养基。该基本培养基亦可缺少有机氮源或铁源，或含有70mM或以下的磷酸盐。于有些具体实施例，该基本培养基可包括葡萄糖。该基本培养基的pH值可介于7.0至8.5。

于以下说明将详细列述本发明之一或多项具体实施例。本发明的其他特征、目的与优点，将从这些详细描述与图式，以及从权利要求中显而易见。

具体实施方式

本发明描述一种制造重组脂质化多肽(亦即，脂蛋白)的方法，其藉由将经适应表现该多肽的大肠杆菌宿主细胞培养于能使该多肽以脂质化形式表现的基本培养基中。以下所述数据证明，使用基本培养基(例如M9培养基)可增加成熟脂蛋白于大肠杆菌的表现。

较佳地，该大肠杆菌宿主菌株是，对于因过度表现外源性蛋白质而被诱发的毒性作用具有抗性者。此类大肠杆菌株可经由于美国专利案号6,361,966中所描述的方法加以鉴定或产生。此等大肠杆菌株的实例包括（但不限定于）C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB40885)及C2014(DE3)(NCIMB40884)。

可使用前述任一种大肠杆菌株来制造呈脂质化形式的重组或天然脂蛋白。天然脂蛋白或脂质化蛋白为一种于其天然状态下被脂质化的蛋白质。于一项实例，天然脂蛋白为一种分枝杆菌的脂蛋白，例如Braun脂蛋白。例举性Braun脂蛋白列示于DOLOP，其为细菌脂蛋白的数据库(因特网网址:mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop）。可基于它们的胺基酸序列，使用亦提供于DOLOP数据库的脂蛋白-预测软件，而鉴定得的其他Braun脂蛋白。参见因特网网址mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop/analysis.shtml。