[发明专利]用于RT-PCR反应缓冲液中的细胞裂解的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过PCR的RNA表达分析领域。更具体而言，本发明提供了新方法以便执行从仅少数细胞的材料开始的表达分析，以及通过实时PCR对所述样品DNA执行后续直接分析。

发明背景

在过去数十年中，PCR已成为用于DNA分析的“役用马（working horse）”，因为它允许指数扩增核酸。特别地，实时PCR（也称为qPCR）已成为有力工具，因为它允许同时分析扩增过程中的扩增的核酸，或不含中间空档，通过解链曲线分析直接在扩增反应后分析扩增的核酸。

此外，PCR以及RT-PCR的自动化已取得显著进展，因为qPCR系统目前是可获得的，其允许以微量滴定板形式平行执行96、384或1536个反应。系统也已变得更加用户友好。例如，微量滴定板是商购可得的，其中每个反应容器已包含冷冻干燥形式的执行PCR或RT-PCR扩增或扩增和检测所需的化合物，并且客户仅需要在实际反应自身之前加入包含待分析核酸的样品。替代系统由Advalytics（AG 480F）提供，其使得在载玻片上的PCR扩增和检测成为可能。

然而，进一步改善用于PCR和RT-PCR分析的作业流程仍是挑战，特别是如果分析仅可以对源于仅小数目细胞的RNA执行。在常规实时PCR中，DNA或RNA首先在耗时步骤中从细胞分离，其可以导致材料的丢失。在收获后，将细胞裂解并且将DNA至少部分从裂解物中纯化，因为若非如此，PCR扩增可能至少被定量地抑制。

在这个背景中，本发明潜在的技术问题是提供改善和可自动化的高流通量方法，其允许进一步简化的核酸分析方案。

发明概述

本发明提供了用于扩增RNA靶核酸的方法，其包括步骤

a）将包含一个或多个活细胞的具有第一体积的液体样品转移到容器内

b）向所述容器中加入具有第二体积的一步RT-PCR反应缓冲液，其中所述第二体积是所述第一体积至少2x大

c）通过在至少90℃温育至少20秒，裂解所述容器内的所述一个或多个活细胞

d）通过聚合酶链反应用能够执行一步RT-PCR的热稳定的DNA聚合酶扩增所述靶核酸而不执行中间纯化步骤。

其中在步骤b）过程中加入的一步RT-PCR反应缓冲液另外包含热稳定的DNA聚合酶和dNTPs。

步骤b）的所述一步RT-PCR反应缓冲液可以另外包含至少一对扩增引物和任选的至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物。

可替代地，所述容器包含至少一对PCR扩增引物和任选的至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物的干燥组合物。

在一个实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶的活性在步骤c）过程中被热活化。

此外，在与上文公开的实施方案不相互排斥的一个实施方案中，所述聚合酶是Tth聚合酶。

在本创造性方法的一个实施方案中，包含至少一个或多个活细胞的所述液体已在步骤a）之前通过细胞分选方法获得。

优选地，步骤a）的所述活细胞的数目与在其中执行步骤d）的聚合酶链反应的液体体积相比较的比值不超过2细胞/μl。

优选地，将被扩增的核酸是RNA。如果靶RNA仅以极低量表达和/或由单拷贝DNA转录，那么这也在本发明的范围内。

在特定实施方案中，所述样品具有小于2μl的体积，并且在步骤b）和c）之间，所述样品在37℃ - 65℃之间的温度温育30秒 – 5分钟。

在另一个方面，本发明提供了包含设计为适合热循环仪仪器的多个反应容器、包含能够执行一步RT-PCR的热稳定的DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应缓冲液的试剂盒。

在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一对扩增引物，和任选的至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物。

在替代实施方案中，在所述试剂盒内的所述反应容器包含至少一对PCR扩增引物和任选的至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物的干燥组合物。

所述多个反应容器可以以微量滴定板或反应容器的线性条的形式彼此物理连接。

此外，在这样的试剂盒内的所述热稳定的聚合酶可以优选通过在90℃温育至少1分钟被热活化。

发明详述

一般来说，本发明提供了允许裂解液体环境中的细胞样品的方法，其随后直接用于通过应用一步RT-PCR的RNA表达分析，而无需任何中间纯化步骤或复杂的液体处理程序。更精确而言，本发明提供了用于扩增RNA靶核酸的方法，其包括步骤

a）将包含一个或多个活细胞的具有第一体积的液体样品转移到容器内