[发明专利]一种使用N-硫代化合物用于寡核苷酸合成的新方法

说明书

技术领域

本发明要求于2010年6月30日提交的美国临时专利申请号N°61/360324的优先权，该专利申请涉及通过使用新颖的硫化剂制备寡核苷酸，出于所有的目的将其全部内容通过引用而结合。 

背景技术

寡核苷酸属于生物制药的一个类别，其具有用于治疗不同疾病的大的潜能，这些疾病列举几个包括癌症、病毒感染、以及炎性疾病。推进作为治疗剂的寡核苷酸的一个重要方法涉及对寡聚体骨架的改性，以便提供在其他事物之间的代谢耐受性、化学稳定性，并且以便改进体内到作用点的输送。改性的骨架化学物质的实例包括:肽核酸(PNA)(参见，Nielsen(尼尔森)，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]，208:3-26，2002)、锁核酸(LNA)(参见，Petersen(彼得森)&Wengel(文格尔)，Trends Biotechnol.[生物技术动向]，21(2):74-81，2003)、硫代磷酸酯(参见，Eckstein(艾克斯坦)，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.[反义核酸药物开发]，10(2):117-21，2000)、甲基膦酸酯(参见，Thiviyanathan(特维亚纳桑)等人，Biochemistry[生物化学]，41(3):827-38，2002)、氨基磷酸酯(参见，Gryaznov(格里亚兹诺夫)，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]，1489(1)；131-40，1999;Pruzan(布鲁赞)等人，Nucleic AcidS Res.[核酸研究]，30(2):559-68，2002)、三亚乙基硫代磷酰胺(参见，GryaznoV(格里亚兹诺夫)等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids[核苷、核苷酸和核酸]，20(4-7):401-10，2001;Herbert(赫伯特)等人，Oncogene[癌基因]，21(4):638-42，2002)。 

与大量选择用于将未取代的硫原子引入到磷酯中有用的试剂相比，允许对具有受保护的硫的H-膦酸酯的酯类进行硫化的基团的范围是有限的(例如，Dreef(瑞弗)等人的，Synlett[合成有机化学快报1，481-483，1990，U56，506。894)。实际上，在寡核苷酸的溶液合成过程中，在该反应中仅仅已经广泛地使用了氰基乙基硫基团，其中在各个步骤使用色谱纯化。本申请人名下的专利申请PCT/EP2009/067902披露了新颖的硫化试剂、其制造方法，以及其在经由H-膦酸酯方法在溶液中经济和方便的合成和纯化 硫代磷酯酸寡核苷酸中的用途，将该专利申请的内容通过通过引用结合到本专利申请中。溶液合成寡核苷酸的关键问题涉及在各个合成步骤以优异特异性获得高底物转化的必要性，给出了处于有助于简单纯化的形式高纯度产物，特别地避免了色谱法。假设缺乏允许经济的溶液相合成的方法，该溶液相技术似乎目前没有被用于商业规模的寡核苷酸合成。 

本发明现在做出了一种可获得的用于通过使用新颖的硫化试剂合成寡核苷酸的新方法，该方法允许值得注意地在溶液中来经济且有效地合成和纯化寡核苷酸。 

发明的披露内容 

本发明特别地涉及一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用具有通式(I)的硫化剂: 

其中 

R是选自由通过一个环形碳原子而结合到S原子上的芳基基团和杂芳基基团组成的组。 

R₁和R₂独立地是有机残基，优选是C1-C20烃残基，任选是不饱和的或芳香族的; 

用于硫化所述寡核苷酸的一个前体的至少一个磷核苷酸间连键。 

本发明具有超过现有P-S键形成方法的多个优点，特别是在优选经由H-膦酸酯方法进行的寡核苷酸合成中。例如，用新颖的试剂转移例如到寡核苷酸上的残基R可以有助于寡核苷酸的结晶或沉淀，允许使用极小或不用色谱法来简单地纯化这些产物。在研发用于寡核苷酸合成的经济方法中一个重要的因素，尤其是在溶液也是在寡核苷酸链延伸的各个步骤中对转化产物的纯化。即使根据本发明的方法确保了产物的高产量和纯度，但各个延伸循环总体上包括三个步骤，并且有利的是除去了甚至是少量的杂质，这些杂质会以其他方式沿着该途径累积。因为大量的步骤，在各个步骤中使用色谱法可能在实际大规模的寡核苷酸合成中不会在经济上是可行的。