[发明专利]供植物中基因靶向用的工程化降落场

说明书

优先权要求

本申请要求2010年1月22日提交的美国临时专利申请流水号61/297,641关于“ENGINEERED LANDING PADS FOR GENE TARGETING IN PLANTS”的提交日的权益。

发明领域

一般地，本发明涉及用于生成转基因生物体，例如植物的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明的方法容许将工程化降落场(engineered landing pad,ELP)掺入基因组位点中，由此便于将其它感兴趣的核酸分子导入含有一个或多个ELP的限定基因组位点中。在一些实施方案中，ELP可以包含含有在锌指核酸酶(ZFN)结合位点侧翼的基本上随机的序列的核苷酸序列区。

发明背景

许多植物用来自其它物种的基因遗传转化以导入期望的性状，诸如以经由例如改善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性；实现自植物生成工业上有用的化合物和/或材料；和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育转基因植物的回收可以用于进行植物的此类修饰，并且已经容许植物的遗传工程(例如用于作物改良)。在这些方法中，通常将外来DNA随机导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，以生成经稳定转化的植物细胞。

第一代转基因植物通常通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化技术生成。用这些技术获得的成功激励开发将感兴趣的核酸分子导入植物基因组中的其它方法，诸如原生质体中PEG介导的DNA摄取、微粒轰击、和硅须晶(whisker)介导的转化。

然而，在所有这些植物转化方法中，掺入植物基因组中的转基因以随机方式且以不可预测的拷贝数整合。通常，转基因可以以整个转基因或其部分的重复形式整合。此类复杂的整合样式可以影响转基因的表达水平(例如，通过经由转录后基因沉默机制破坏转录的RNA，或者通过诱导对导入DNA的甲基化实现)，由此下调转基因的转录。还有，整合位点本身可以影响转基因的表达水平。这些因素的组合导致感兴趣的转基因或外来DNA在不同转基因植物细胞和植物系间的表达水平的广泛变化。此外，感兴趣的外来DNA的整合可以对基因组中发生整合的区域具有破坏性影响，而且可以影响或扰乱所述靶区域的正常功能，由此经常导致不想要的副作用。

以上需要无论何时调查将特定外来DNA导入植物中的影响，生成并分析大量转基因植物系以获得显著的结果。同样地，在转基因作物植物的世代中，在植物中导入感兴趣的特定DNA以提供具有期望表型的转基因植物的情况中，创建独立创建的转基因植物系的大群体以容许选择具有最佳转基因表达，且对转基因植物的总体表型具有最小或无副作用的那些植物系。特别在此领域中，例如鉴于繁琐的管理要求和与消除不想要的转基因事件需要的重复田间试验有关的高成本，更定向的转基因方法是期望的。此外，会清楚的是，靶向性DNA插入的可能性在转基因叠加过程中也会是有益的。

已经开发出几种方法以控制植物中的转基因插入。见例如Kumar和Fladung(2001)Trends Plant Sci.6:155-9。这些方法依赖于基于同源重组的转基因整合。此策略已经在原核生物和低等真核生物中成功应用。Paszkowski等(1988)EMBO J.7:4021-6。然而，对于植物，直到最近，转基因整合的主要机制基于非常规重组，其牵涉重组DNA链间很少的同源性。因此，此领域中的主要挑战是检测罕见的同源重组事件，其被经由非常规重组有效得多地整合导入的外来DNA掩盖。