[发明专利]供植物中基因靶向用的工程化降落场

权利要求书

1.一种用于生成转基因植物或植物组织的方法，该方法包括：

提供核酸分子，该核酸分子包含与植物细胞的基因组DNA基本上缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区和至少一个靶向性内切核酸酶识别位点，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏基本的性序列同源性的所述至少两个核酸序列区在所述至少一个靶向性内切核酸酶识别位点侧翼；

用所述核酸分子转化所述植物细胞或包含所述植物细胞的植物组织，其中所述核酸分子稳定整合入所述植物细胞的基因组中；并

自用所述核酸分子转化的所述植物细胞生成植物组织或再生植物。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸分子进一步包含不同限制性位点。

3.权利要求2的方法，其中所述不同限制性位点包含相容的单链末端，其容许多个ELP的连环化。

4.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区不包含可读框。

5.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少一个核酸序列区不包含可读框。

6.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区是约50bp至约3kb。

7.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区选自下组中的一种或多种：序列ID NO 1到10。

8.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区和靶向性内切核酸酶包含序列ID 15和16。

9.权利要求1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区和靶向性内切核酸酶包含并入用于转化单子叶植物、双子叶植物，包括芸苔的植物转化载体pDAB104137、pDAB104139、pDAB104141、或pDAB104143中的序列ID 15和16。

10.依照权利要求1的方法，其中所述靶向性内切核酸酶是锌指核酸酶。

11.权利要求1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中稳定地随机整合。

12.权利要求1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中在一个或多个已知靶位点处稳定整合。

13.权利要求1的方法，其中所述核酸分子稳定整合入染色体或微型染色体的扩增区中。

14.通过权利要求1的方法生成的转基因植物组织或植物。

15.由权利要求14的转基因植物生成的种子。

16.一种用于生成转基因植物的方法，该方法包括：

提供自权利要求8的转基因植物组织或植物分离的细胞或组织；

提供至少一种靶向性内切核酸酶或包含编码所述至少一种靶向性内切核酸酶的核酸序列的第一核酸分子，其中所述至少一种靶向性内切核酸酶识别导入所述转基因植物的基因组中的至少一个靶向性内切核酸酶识别位点；

提供第二核酸分子，其包含感兴趣的核酸序列和在所述感兴趣的核酸序列侧翼的两个额外的核酸序列，其中所述两个额外的核酸序列各与同基因组DNA缺乏序列同源性的两个核酸序列区之一同源；

将(i)所述至少一种靶向性内切核酸酶或所述第一核酸分子；和(ii)所述第二核酸分子导入所述植物细胞或组织中，其中所述感兴趣的核酸序列稳定整合入所述植物细胞的基因组中；并

自用所述第一和第二核酸分子转化的植物细胞或组织再生植物。

17.通过权利要求16的方法生成的转基因植物。

18.由权利要求17的转基因植物生成的种子。

19.权利要求1的方法，其中所述核酸分子在每个末端侧翼有一个或多个额外的靶向性内切核酸酶识别位点。

20.权利要求19的方法，其进一步包括将识别所述一个或多个额外的靶向性内切核酸酶识别位点的一种或多种靶向性内切核酸酶导入所述植物组织或植物中，其中自所述植物组织或植物的基因组切除所述核酸分子。

21.依照权利要求16的方法，其中所述靶向性内切核酸酶是锌指核酸酶。