[发明专利]用于测定蛋白磷酸酶和激酶活性的基于FRET的方法

说明书

关于由美国政府提供的资金的声明

本发明是由政府支持，在NiH Grant No.R01DK066422——由美国政府的美国国家卫生研究院授予——下进行的。政府在本发明中拥有一定的权利。

发明领域

本公开内容涉及测定蛋白磷酸酶和激酶活性的方法。本公开内容还涉及患者中钙依赖磷酸酶活性和免疫抑制的临床监测方法，其可用于预测患者中的移植接物受性。

背景技术

钙依赖磷酸酶是依赖于钙的、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其是涉及各种途径——包括T细胞的信号转导介质。钙依赖磷酸酶有三种同种型(isoform)的催化亚基——α，β和γ。α和β同种型的特有的不同功能已被识别。重要的是，β同种型似乎是T细胞正常活动所需的主要同种型。

将钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A和FK506加入到免疫抑制方案(immunosuppressive regimen)中降低急性同种异体移植排斥的发生，并有效地使肾移植患者的一年存活加倍。然而，长期移植存活的改善远不显著，仅有分别66%和78%的已故供体和存活供体接受者存活5年。当针对不同种族群体来考虑时，该统计结果甚至更引人注目。80%的接收活供体器官的白种人存活5年，而仅64%的非洲裔美国人获得那么久。针对已故供体器官的接收者，观察到类似的趋势；对于白种人有70%的存活率，而对于非洲裔美国人仅为55%。理解造成移植患者的迥异结果的机制是极其重要的一个领域。尽管已付出相当多的努力，但对于足以解释长期结果中的种族差异的潜在原因尚未达成共识。

环孢菌素A(CsA)和FK506(他克莫司(tacrolimus))通过抑制钙依赖磷酸酶来发挥它们的免疫抑制作用。已知钙依赖磷酸酶在T细胞受体下游被激活并调节转录因子——包括活化的T细胞的核因子(NFATs)。反过来，NFATc蛋白控制细胞因子的表达，所述细胞因子包括IL-2和IL-4。对钙依赖磷酸酶/NFAT活性的阻碍抑制T细胞活性并导致免疫抑制作用。尽管环孢菌素A已经在临床上使用了20多年，而FK506使用超过十年，但用于免疫抑制维持的目标血液水平尚未被适当界定。治疗性监测环孢菌素谷浓度已经被证明是较差的临床指示物，因为一些患者在足够的或者高血液环孢菌素浓度存在的情况下经历排斥，而其它患者在血液谷浓度低的时候出现毒性。环孢菌素剂量和临床免疫抑制作用之间的差异表明，钙依赖磷酸酶活性本身可能是可变性的来源。然而，仅存在直接测量钙依赖磷酸酶活性的有限的研究，而且，没有关于可能影响钙依赖磷酸酶对环孢菌素和FK506抑制的敏感性的因素的数据。

发明内容

本公开内容包括在溶液中(in-solution)检测和测量肽的修饰的方法以及检测和测量介导这种修饰反应的酶(例如，磷酸酶和激酶)的活性水平的方法。检测，如磷酸酶活性的分析已经利用二氧化钛涂覆的板(plate)来分开磷酸化的与未磷酸化的肽底物。然后，通过已与肽连接的荧光标记检测二氧化钛结合磷酸化肽或未结合去磷酸化肽。

虽然比放射性标记肽的其它方法有明显优势，但该分析也存在若干缺点，包括需要移动样品从反应板到分离板到检测板。在本公开内容的方法中，可以在一个反应中完成整个程序。使用与荧光团，如荧光素结合的二氧化钛微珠，并且，利用荧光共振能量转移(FRET)技术定量检测仅与微珠结合的被修饰的肽。本公开内容的系统仅检测与二氧化钛结合的被修饰的肽，并且微珠可以保持悬浮或者结合到固体表面，如所期望的。

因此，本公开内容的一个方面包括测定肽修饰酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供分析反应混合物，其包括目标肽，所述目标肽包含被肽修饰酶特异识别的氨基酸序列和与所述目标肽结合的第一荧光团种类；缓冲混合物，其被配置成允许肽修饰酶修饰所述目标肽；和测试样品，其被怀疑含有肽修饰酶；(b)在适于肽修饰酶修饰目标肽的条件下，温育所述分析反应混合物；(c)在适于二氧化钛结合被修饰的目标肽但不结合未被修饰的目标肽的条件下，使所述温育的反应混合物与二氧化钛接触，所述二氧化钛具有结合在其上的第二荧光团种类；(d)以所述第二荧光团种类的激发波长照射所述二氧化钛，由此，所述第二荧光团种类发射第一荧光，所述第一荧光通过FRET激发所述第一荧光团种类，从而诱导从所述一荧光团种类发射第二荧光，所述第二荧光的波长不同于所述第一荧光的波长；(e)选择性地检测所述第二荧光，从而检测被修饰的目标肽与二氧化钛的结合；(f)测定所述第二荧光的强度；和(g)使所述第二荧光的强度与结合于所述二氧化钛的、被修饰的目标肽的量关联。