[发明专利]葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法，特别是涉及葡萄球菌肠毒素A(SEA)和B(SEB)的检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是常见的食物中毒致病菌，能引起人和动物多种疾病，其致病性主要与其分泌的肠毒素密切相关。葡萄球菌肠毒素(SEs)是一组耐高热的低分子量可溶性蛋白，其中SEB是食物中毒的重要致病因子，并被列为生物战剂的主要毒素之一。SEB蛋白对热稳定，引起食物中毒的最低浓度是200ng/100g食品，误食被其污染食品的人在4～6h后引起恶心、呕吐及腹泻，因此，研究快速灵敏的检测SEB和其他多种SEs，如SEA，SEC₁，SEC₂等的方法显得尤为重要，理想的食品检测手段对SEB的检测应该达到ng/mL级，而且样品不需过多的处理。

目前，SEs的检测的方法有单、双向琼脂扩散法、反向间接血凝法(RPHA)、固相放射免疫法(RIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)等免疫学方法。血清学方法所需的抗体制备工艺繁杂，周期长，效价受到众多生物因素的影响。RIA、ELISA和RPHA检测灵敏度虽然可达ng级，但其实验条件要求苛刻，反应中有假阳性出现等缺点限制了其应用范围。近年来又发展起来的基因探针检测方法，由于放射性同位素标记探针的半衰期短及放射污染等缺点限制了该技术的推广应用。随着科学技术的发展，出现了分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)，该技术又称分子烙印(molecular imprinting)，属超分子化学中主客体化学范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的一门交叉技术。该技术具有特异选择性的聚合物的过程，当模板分子与聚合物单体接触时会尽可能地同单体形成多重作用点，如果通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用点的空穴。获得的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)具有模拟生物抗体的功能，被形象的称为“人工抗体”，已成为当今研究的热点课题之一，其制备过程简单，成本低廉，物理化学性质稳定，并且具有效预定性、特异识别性和广泛实用性。但传统的印迹聚合物是三维块体，一般密度较大，大分子模板难以达到和离开结合位点，不良的物质传输和永久的模板保留对识别性能产生负面影响，再由于常规的非生理性印迹条件和实验中常用的有机溶剂都会使蛋白变性，使得三维的印迹技术并不适合识别大分子蛋白质。

二维蛋白分子印迹仅使模板蛋白分子印迹在聚合物的表面，印迹位点也处于薄膜的表面，这可克服空间位阻的影响，便于除去模板和蛋白分子接近识别位点，而且使用的溶剂大多数是温和型和水溶性溶剂，以及生物实验中常用的缓冲液，可使得靶标蛋白质保持其生理活性和正常的空间结构。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种葡萄球菌肠毒素的二维分子印迹阵列式质量传感检测方法，包括如下步骤：

(1)石英晶振电极表面活性处理；将三个表面镀金的石英晶振电极浸入0.05-0.2M的11-巯基醇酸的乙醇溶液中，浸泡8-16h，取出，用无水乙醇冲洗，氮气吹干，分别标记为A、B和C电极；

(2)初始溶胶凝胶的制备：

将2～3mL原硅酸四乙酯，100～200μl苯基三甲氧基硅烷，100～200μl甲基三甲氧基硅烷，400～600μl浓度为0.05-0.2M的HCl水溶液和2～3ml的H₂O混合，超声20～30分钟制备成初始溶胶凝胶；

(3)含有SEA或SEB模板的印迹溶胶凝胶的制备：

取2～4mL初始溶胶凝胶和100～200μl浓度为0.1～0.3mg/mL的SEA磷酸盐缓冲液，混合均匀，超声20-40分钟，获得含有SEA模板的印迹溶胶凝胶；

取2～4mL初始溶胶凝胶和100～200μl浓度为0.1～0.3mg/mL的SEB磷酸盐缓冲液，混合均匀，超声20-40分钟，获得含有SEB模板的印迹溶胶凝胶；

(4)对石英晶振电极表面进行涂布处理：