[发明专利]一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法

说明书

技术领域

本发明属于基因克隆领域，涉及一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法。

背景技术

白细胞介素32，原命名为细胞杀伤因子4型变体(NK4)。是Kim等在用基因芯片研究IL18高诱导表达因子时，发现有一种高表达细胞因子样基因，编码炎症性细胞因子，因此命名为白细胞介素32。

目前研究发现，人类IL-32基因定位于人染色体16p13.3上，含有8个外显子，通过不同的可变剪切成6种构型，分别为α、β、γ、δ、ε和ζ，其中γ型在其N端有一个疏水信号肽，可介导该蛋白跨膜表达。IL-32的6种构型都具有生物活性，其中以γ构型[Ji-Da Choi，Su-Young Bae，et al.Identificationof the most active interleukin-32 isoform[J].Inmmunology，2008，126：535-542]的生物活性最强，可能与其N端信号肽有一定关系。

研究表明IL-32的主要作用是通过NF-κB[Kim SH，Han S Y，et al.Interleukin-32：A Cytokine and Inducer of TNF α[J].Immunity，2005，22：131-142]和P38-MAPK磷酸化途径诱导TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子的产生。因为IL-32主要由IFN-γ诱导产生，且IL-32mRNA在免疫组织中的表达高于其它组织中的表达，这表明IL-32在固有性免疫中发挥作用[李莉，宝福凯.白介素-32及其与炎症性疾病的关系研究进展[J].中国热带医学，2010，10(6)]。固有性免疫是依赖于非特异性免疫细胞的病原体识别受体的免疫，具有代表性的病原体识别受体是Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)和核苷酸结合的寡聚化结构域蛋白(Nucleotide binding oligomerization domainprotein，NOD)，通过对病原体相关分子模式(Pathogen-associated moleculepatterns，PAMP，病原体表面的保守分子)的识别而发挥作用。IL-32协同NOD1和NOD2配体，通过胱天蛋白酶-1依赖的信号通路激活IL-1β和IL-6。同时，由于IL-32诱导多种细胞因子的产生且与多种炎症性疾病密切相关，揭示了IL-32在适应性免疫应答中也发挥作用，是一种前炎症反应细胞因子，它与疾病的严重性程度有关，尤其是自身免疫性炎症性疾病。

自从2005年白细胞介素32基因被命名以来，对于其研究主要集中于人上。直至2010年10月，才有人克隆出了牛白介素32的beta构型[Jun Jaekal，Hyunjhung Jhun，et al.Cloning and characterization of bovineinterleukin-32 beta isform[J].Veterinary Immunology andImmunopathology，2010，137：166-171]并且有研究猜测，小鼠中无此基因的存在。本发明通过分子克隆研究，克隆出牛白细胞介素32基因gamma亚型，并对其功能进行验证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法，牛IL-32γ基因(GenBank序列号为JQ327711，未经公布)的表达可以提高动物机体内其他相关免疫因子的表达，并进一步提高动物免疫系统的免疫作用，且有文章报道该基因对抵抗结核杆菌有一定的效用，因此，该基因的克隆及其基本功能验证，将为解决牛结核杆菌病的转基因克隆牛提供可靠的基因选择。

本发明的技术解决方案是：

一种克隆牛IL-32γ基因的方法，其特殊之处在于：通过将人IL-32与牛的基因比对，分子克隆了牛IL-32γ基因。

一种整合牛IL-32γ基因的真核表达载体，其特殊之处在于：包含目的基因牛IL-32γ及通过IRES序列与其相连的GFP序列；包括抗性筛选基因neo基因。

上述的整合牛IL-32γ真核表达载体，其特征在于：该载体通过用BamHI和SalI酶切将牛IL-32γ基因克隆到表达载体pIRES2-EGFP载体上。

上述载体的小鼠巨噬细胞，其特征在于：其宿主细胞是小鼠巨噬细胞系RAW264.7，通过脂质体转染的方法将目的基因牛IL-32γ整合到小鼠巨噬细胞的基因组中。