[发明专利]动物细胞“友好”基因座的筛选载体和筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养生产领域，更具体地，涉及一种动物细胞“友好”基因座的筛选载体和筛选方法。

背景技术

目利用动物细胞大规模培养的方法生产生物医学和工农业需要的稀有蛋白质，属于生物技术领域范畴。动物细胞大规模培养的技术，是20世纪80年代以来生物技术工业中的重要领域之一。应用体外培养的动物细胞生产外源蛋白质，其主要原理是将体外重组的基因转移到动物体细胞中，利用细胞本身的蛋白质合成机制，实现异种蛋白质从基因到蛋白质的生物转化过程。在细胞培养技术的具体应用上，又可分为基因瞬时表达(本文“表达”一词指的是从基因到蛋白质的生物转化过程)和永久性表达两大类。瞬时表达的技术特点是外源基因并不插入动物细胞的染色体，而是以质粒的形式存在于细胞质中，利用细胞合成蛋白质的诸要素，在细胞质中合成异种蛋白质。由于被转入的外来基因不能随着细胞的分裂而倍增，外源基因将很快被丢失，所以它的表达是瞬时的。外源基因在细胞中永久性表达，是把外来基因插入动物细胞的染色体，使其变成动物基因组的一部分，能够随细胞的分裂而倍增，因而能够永久的遗传下去。染色体上整合了外源基因的动物细胞是基因工程细胞，是生产高附加值蛋白质产品的重要工具。动物细胞培养技术经过一个世纪的不断完善，现在已经达到很高的水平，上百种生物医学产品已经上市。动物细胞培养生产的产品主要有三大类：(1)动物细胞自然合成或在外源基因指导下合成蛋白质产品，如：干扰素、EPO、tPA、各种单克隆抗体和酶类产品；(2)利用动物细胞作为宿主生产其他生物体，如：繁殖各种病毒制作疫苗；(3)细胞本身就是产品，如：生产相关细胞用于皮肤和骨髓移植，用于基因治疗等。随着技术的不断改进，未来将会有更多动物细胞培养的产品投入市场。

近30年来，动物细胞培养技术的研究方向，主要集中在开发细胞大规模培养的关键技术。现在，已经开发出适宜细胞贴壁培养和悬浮培养的多种大规模培养器具，研制出适应不同细胞的培养基，特别是无血清培养基，解决了许多在细胞大规模培养条件下产生的代谢问题。但是，用细胞培养法生产产品的总产量，是每个细胞的单产乘以所培养的细胞总数的乘积。因此，在解决了细胞大规模培养条件之后，进一步提高产量的主要因素，只能是提高每个细胞的单产。半个世纪以来，转基因动物研究实践积累了丰富的有关基因表达调控的知识，其中最值得注意的现象是，用同样一种基因结构制作的转基因动物，目标产品的产量可以相差数万倍。造成这种差别的最主要原因，是外源性基因在染色体上的整合位点不同。也就是说，外源基因所处的基因环境能极大地影响它的表达水平，由此提出了对外源基因“友好”和“不友好”的基因座的科学概念。当然，在数万个基因座中寻找“友好”基因座，使用转基因动物几乎不可能，因为能够生产出的转基因动物数量有限。但是，把这个科学概念从动物整体移植到单个动物细胞上，不仅可以培育高水平表达外源基因的基因工程细胞株，而且可以借助体细胞克隆技术，将细胞变成动物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种动物细胞“友好”基因座的筛选载体和筛选方法，其借用转基因动物研究中提出的概念，设计了一套技术流程，用来从动物细胞基因组数万个基因座(Locus)中，筛选能够使外源基因高水平表达的“友好”基因座。同时，在选出的基因座中装上一套引导基因序列高频率交换的生物元件，以便反复利用同一个“友好”基因座去表达不同外源基因。本发明是现有动物细胞培养技术体系的重要补充和改进，对提高各类动物细胞培养产品的产量有很大作用。同时，本发明的科学概念和技术体系，可以延伸到转基因动物研究和开发领域。

本发明的技术方案为：

一种动物细胞“友好”基因座的筛选载体，其特征在于：所述载体由骨架部分和关键功能部分组成，所述骨架部分包括M13的DNA复制子Ori、在大肠杆菌中的筛选标记基因Amp、在真核细胞中的筛选标记基因Noe以及人的巨大病毒早期蛋白基因的启动子CMV，所述关键功能部分包括引导肽、标记基因GFP、连续的三个蛋白酶识别位点、His-tag以及LoxP和Lox2272序列，所述关键功能部分的的基因序列如SEQ ID NO：1。

一种动物细胞“友好”基因座的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)通过细胞复苏、接种细胞以及细胞转接完成对细胞的培养；

(2)通过细胞转染法使权利要求1所述的载体转染培养好的细胞；

(3)对被转染的细胞添加筛选药物G418并逐步提高筛选药物G418的含量，筛选出高抗性的细胞；

(4)测定筛选出的高抗性细胞的GFP基因表达水平，筛选出高效表达GFP基因的细胞；