[发明专利]L-半胱氨酸酶法转化制备方法

说明书

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。

二、背景技术

L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其所带的巯基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于医药领域、化妆品工业、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用。

根据目前文献报导L-半胱氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。

1、提取法

目前国内生产L-半胱氨酸主要以人或动物毛发为原料，先经酸水解提取L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法大规模工业化生产受到原料来源的限制，产物中易混入其它氨基酸，分离难度大，环保成本高。也有厂家在生产L-半胱氨酸的相关产品中回收L-胱氨酸，曾庆群等(CN 101104599A，2008)对N-乙酰-L-半胱氨酸生产过程中排放的废液进行氧化处理，分离回收了L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生产成本。

但是，近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用由动物毛发为原料制得的L-半胱氨酸，因此寻求新的制备L-半胱氨酸的方法势在必行。

2、化学合成法

化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应、加成反应、还原反应、取代反应，最后得到DL-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体，需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。

马云峰(CN 1876628A，2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，以D-二苯甲酰酒石酸或L-二苯甲酰酒石酸为拆分剂，将外消旋半胱氨酸与拆分剂按一定摩尔比溶于稀的无机酸溶液中，保温搅拌、冷却结晶，分别制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。

3、发酵法

目前发酵法生产L-半胱氨酸正处于实验室探索阶段，其主要问题是微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂，且巯基来源难以解决。

张建国(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大肠杆菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫代硫酸钠等成分的培养基中发酵产生了L-半胱氨酸，基因改造前的大肠杆菌BL21(DE3)L-半胱氨酸产量几乎为0，而基因改造后的BL21(DE3)L-半胱氨酸产量达到1g/L。

托马斯·迈尔(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代谢去调节、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分的培养基中补料分批发酵，流加葡萄糖及硫代硫酸盐，发酵48h后发酵液中L-半胱氨酸含量达到22.6g/L。

Takagi Hiroshi(EP1234874，2002)以棒状杆菌为出发菌株，通过基因改造提高胞内丝氨酸乙酰转移酶活性，同时降低半胱氨酸脱巯基酶活性，在含葡萄糖、硫酸铵等成分的产半胱氨酸培养基中发酵，积累了L-半胱氨酸和L-胱氨酸。

4、酶转化法

自1979年Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology，34(6)：806-810，1977)发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌转化DL-2-氨基-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为L-半胱氨酸以来，酶法生产L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。

日本具有用DL-ATC为原料酶法制备L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺，国内学者也做了相关研究。王普(CN 100467587C，2009)以假单胞菌zjwp-14湿菌体或粗酶液为酶源，以DL-ATC为底物，于20～52℃酶促转化1～9h，得到含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。陈宁(CN 101348809A，2009)以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138为供试菌种，以全细胞为酶源酶法转化DL-ATC合成了L-半胱氨酸。

以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化学合成DL-ATC，且酶转化过程中需要多步酶促反应，整体催化效率不高。

焦庆才等(Bioresource Technology，102：3554-3557，2011)以L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pET-28a-trpBA/BL21)酶法合成了L-色氨酸。但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化L-丝氨酸和硫氢化钠反应生成L-半胱氨酸。