[发明专利]同时检测谷物中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法。

背景技术

真菌毒素是指在产毒丝状真菌的生长代谢过程中，分泌产生的对人畜健康有害的次生代谢产物。由于这类真菌毒素分布广，某些毒素还具有致畸、致癌和致突变等作用，近年被世界卫生组织列为食源性疾病的三大根源之一。由于产毒真菌在适宜条件下，极易在产前产后侵染农产品，导致真菌毒素的污染，进而威胁人类和畜禽的健康，也带来了巨大的经济损失。目前，世界各国虽对真菌毒素建立较为完善的防控措施，但在现有生产力水平下，要完全杜绝真菌毒素进入人类的食物链是无法实现的。

通常条件下，黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFB₁）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等真菌毒素均易出现在霉变谷物中，而且多种毒素并存的现象也有报道，其毒素的加和毒性更是极具威胁。发生多种毒素并存的现象主要是由两方面原因导致的，其一，现代食品工业的高度集成化，增加了不同原料间交叉污染的可能，也极大增加了多种毒素并存的几率，其二，某些产毒真菌，特别是产毒曲霉，在特定的条件下可以分泌多种真菌毒素。但是不管是单一毒素还是多种毒素，都将严重威胁到人和动物的健康。下表为以上所述四种真菌毒素的基本信息。

由于真菌毒素存在范围广，危害大。因此，许多国家和地区已对谷物等农产品中的真菌毒素制定了严格的限量标准和分析方法。但是，由于各种真菌毒素的物理化学性质差异很大，现有的分析方法均是针对单一毒素或者化学结构类似的同族毒素，而且存在检测周期长，成本高，污染大，效率低的缺点，难以有效对谷物中的真菌毒素进行防控；而已有的多真菌毒素检测技术通常是基于检测成本极大的高效液相色谱-串联质谱等尖端仪器设备，但在现阶段，这类高成本的检测技术尚难以在基层推广。

为了最大限度降低人群和畜禽动物面临的真菌毒素暴露风险，减少食品安全隐患。建立一种适用于谷物中多种真菌毒素同时检测的高通量、高灵敏度、低污染、低成本方法就显得极为必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有真菌毒素分析技术存在的缺点和不足，提供了一种同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的高效液相色谱-荧光检测法，该方法具有检测成本低、分析毒素快、灵敏度高和重复性好等特点。

为了实现上述目的，本发明采用通用型提取液，对谷物样品中的真菌毒素提取、净化后，注入高效液相色谱仪分离，并采用荧光检测器检测，以外标峰面积法对样品中的黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素进行定量分析，该方法包括以下步骤：

(1)谷物中待测真菌毒素的提取

(1-1)将谷物样品全部磨碎并通过40目分样筛后，准确称取5 g磨碎的谷物样品，精确至0.01 g，置于50 mL 具盖离心管A中，加入15 mL通用型提取液，剧烈振荡1 min，然后于摇床上以60 r/min振摇20 min，接着加入20 mL乙腈，60 r/min振摇10 min后，加入3 g 无水硫酸镁和2 g氯化钠作为复合盐析试剂，迅速并剧烈振荡1 min，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液至100 mL磨口烧瓶B中； 

(1-2)往离心管A中再加入15 mL乙腈，经过剧烈振荡1 min后，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液，并与步骤（1-1）中取出的提取液合并于烧瓶B中，于40℃下减压浓缩近干；

(2)提取液净化

往烧瓶B中加入4 mL正己烷和1 mL酸性乙腈作为净化试剂充分荡洗，收集荡洗液，以3500 r/min离心后，弃去上层正己烷层，收集下层溶液于2.0 mL离心管C中，并用0.5 mL酸性乙腈重复洗涤烧瓶B 2次，收集荡洗液至离心管C中定容至2 mL，以15000 r/min离心1 min，取上清液过0.22 μm滤膜，得到待测样品溶液，供液相色谱分析；

(3)测定

（3-1）标准工作液和待测样品溶液在设定的液相色谱条件下进样，即将标准工作液和待测样品溶液注入高效液相色谱仪分离，并采用荧光检测器检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，待测样品溶液中真菌毒素的响应值应该在荧光检测器的线性范围内；