[发明专利]猫狗细小病毒通用型PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病的诊断技术，涉及对猫和狗的细小病毒的检测方法。 

本发明提供一种检测猫狗细小病毒的通用型PCR试剂盒。本发明的内容涉及一对可以同时用米检测猫狗细小病毒的PCR引物，以及一套包含了PCR反应mix(含引物)、阳性对照、阴性对照、溴酚蓝上样缓冲液组成的PCR检测试剂盒以及相应的检测操作程序。 

背景技术

猫细小病毒(felinepanleukopenia virus，FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒，是危害猫科动物的主要病原之一；而犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。染病动物的临床症状为高热、呕吐、食欲废绝、体温升高、严重脱水、精神沉郁等。解剖发现有典型肠炎症状，如肠道水肿、出血、黏膜脱落、肠系膜淋巴结肿胀，肝、肾肿大并瘀血等。感染动物特别是发病动物的粪便、分泌物及呕吐物均带毒，病毒可通过直接接触或消化道、呼吸道等途径传播。 

FPV和CPV为单链DNA病毒，基因组之间的同源性超过98％，病毒颗粒具有相同的结构；病毒基因组有2个开放阅读框，分别编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP)；2种病毒均含有VP1和VP2衣壳蛋白，其中VP2是主要的衣壳蛋白，它包括了所有的中和抗原位点，其基因全长为1755bp，编码584个氨基酸，vp2基因上的儿个关键碱基的决定了毒株的抗原特性和宿主范围。如FPV与CPV中VP2蛋白上的第93和323位关键氨基酸残基的差异决定了它们在抗原性上存在较明显的差异。VP2蛋白的N端及其转角结构区Loop 1和Loop 3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导宿主细胞产生中和抗体，这些区域氨基酸残基的变化会导致毒株产生抗原漂移。有研究结果表明，FPV到CPV22的演化仅发生了6个氨基酸(80、93、103、323、564、568位氨基酸)的变化，而CPV22的各个变异株之间也仅有少数氨基酸的变化。由此可见，尽管病毒基因组发生变化的碱基数量不多，但却可导致病毒的抗原性、致病性、细胞嗜性、宿主范围等发生显著变化。 

CPV和FPV这2种病毒在进化上密切相关，一种广为接受的假说是FPV是CPV的祖先。尽管这2种病毒间的关系比较复杂，尤其是CPV，近年米出现了许多变异株，这些毒株间的差异与这2种病毒间的差异对FPV的遗传进化研究带来了困难。尽管CPV和FPV在遗传学和生物学上关系密切，但它们的进化机制却不同。FPV编码非结构蛋白1(NS1)和衣壳蛋白2(VP2)的基因随时间而变化，但VP2蛋白却不发生改变。CPV的VP2蛋白则随其基因的变化而变化。即，在FPV中，NS1和VP2的突变多是同义突变，而CPV的vp2基因突变则主要是错义突变。这说明与FPV相比，CPV更多是在有选择压力的情况下，通过抗原漂移不断产生新的突变株，以逃避宿主的免疫机制。CPV在其出现后的儿年时间里在抗原性、宿 主范围和血凝性上都发生了很多变化，目前已经出现的亚型包括CPV22a、CPV22b、CPV22c(a)和CPV22c(b)等。 

通过对CPV、FPV的致病力研究发现，FPV、CPV22均可在猫源细胞中增殖，但只有CPV22可在犬源细胞中生长。FPV、CPV对本源宿主的致病力要比对异源宿主的致病力强得多。而且随着CPV22亚型的不断变化，各亚型对猫科动物的感染能力也在不断增强。 

目前对细小病毒的检测方法主要有病毒分离培养、荧光抗体技术、电镜及免疫电镜技术、血凝实验及血凝抑制实验、酶联免疫实验等。但以上方法均存在一定的缺点和不足。病毒分离培养要求有必要的实验室条件和专业技术；电镜相关的技术则需要昂贵的仪器设备；荧光抗体技术仅局限于检测病理组织或细胞培养物中的病毒；酶联免疫吸附实验易受干扰因素的影响，且敏感性较差；血凝实验和血凝抑制实验需随时准备新鲜的敏感红细胞，有时还需做血凝抑制实验加以验证。 

PCR可以高敏感性，高特异性的快速检测靶基因DNA。即使当标本中含有痕量细小病毒DNA时亦能高效检出。目前虽已有对犬细小病毒的PCR检测方法的报道，但未有猫细小病毒PCR检测试剂盒的报道，亦没有可以同时检测猫狗细小病毒的通用型试剂盒的报道。 

CPV和FPV的基因组序列高度一致，因此可以根据vp2基因的保守区域设计一对引物，特异性的扩增含有vp2基因高度可变区的片段。 

发明内容