[发明专利]低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是用于测量各种药物对贴壁细胞铺展状态的影响的方法。

技术背景

细胞铺展是贴壁细胞的重要生理活动或功能之一，许多人体生理活动或疾病与细胞的铺展有关。例如，血管内皮细胞通过细胞的铺展来构建血管内壁或者修补破损的血管内皮层，因此，内皮细胞铺展的改变往往与心血管疾病的产生、发展和肿瘤转移等有关，而药物对细胞铺展的影响也必然是评估药物疗效的体外细胞试验中的重要指标之一。

目前，有直接和间接两种方法来测定药物对细胞铺展状态的影响。前者是将药物直接加入已经铺展完全或铺展中的细胞，再测量药物对细胞铺展的影响；后者是先将药物加入铺展完全的细胞中共同孵育一段时间，然后去除溶液中的药物并用试剂诱导细胞去铺展，再观察细胞再次铺展的能力。

胰蛋白酶常被用作细胞去铺展的试剂。然而，胰蛋白酶对细胞膜表面的各种蛋白有较大的损伤作用，而且还不清楚是否会对细胞的各种生理活动（如细胞铺展等）产生影响，因而，这种生化方法会使得药物影响细胞铺展的研究和分析更加复杂化，迫切需要更加温和、无副作用、同时又有效的细胞去铺展的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法，本发明简单、快速、温和、有效地诱导细胞去铺展并动态观察和测定药物对细胞铺展状态的影响的方法，以取代胰蛋白酶去铺展的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

（1）将处于悬浮状态的贴壁细胞种植在培养孔或板上，在培养箱中孵育，让细胞完全铺展开。

（2）加入药物与细胞共孵育20min-1h，随后去除药物。

（3）将药物处理的细胞放置于显微镜下，拍摄细胞去铺展之前的形貌图像。

（4）吸去水溶液，加入4℃的细胞培养液或缓冲液。

（5）立即用显微镜动态观察细胞的去铺展状态，每隔几分钟连续获取细胞形貌图像，约持续30min-1h。

（6）用软件测量出每个细胞的贴壁面积或者每个时间点所有细胞的贴壁面积平均值。

（7）将上述过程得到的数据与空白对照的数据进行比较和分析，得到药物影响细胞铺展的数据。

本发明所述的步骤（3）中，所述的显微镜优选能控制温度在37℃的共聚焦显微镜。

本发明的主要特点是。

（1）过程简单。观察或测量前只需加入低温的培养液或缓冲液就可以。

（2）对细胞无损伤。没有添加任何的生物或化学试剂。

（3）检测快速。基本上可以在1小时内测定。而直接测量方法要用时几个小时甚至24小时。

（4）可动态观察或测量。由于用时比较短，可动态观察整个去铺展过程或药物的影响。

（5）有效。实验数据显示（在具体的实施方案中），这种方法可以检测出药物对细胞铺展的影响。

具体实施方案

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

本发明所述的实施例所使用的成像设备为德国产的Carl Zeiss 710激光共聚焦显微镜，其中细胞贴壁面积的测量，是使用该显微镜的面积测量功能（该显微镜自带的LSM 710 Release Version 5.5 sp2软件）。

实施例1：低温诱导细胞去铺展的定量测量。