[发明专利]一种重组腺病毒的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，具体地说是涉及一种重组腺病毒的制备方法及其用途，该重组腺病毒包含hITF全长基因序列，属生物医学技术领域。

背景技术

严重烧伤不仅可导致大面积的皮肤及皮下组织损毁，各脏器也都存在不同程度的损害，其中胃肠道损害尤为严重，肠道已被视为“烧(创)伤应激的中心器官之一”。烧伤后胃肠粘膜屏障功能受损是引发肠源性感染、肠源性高代高、全身炎症反应综合症(SIRS)，乃至多器官功能障碍(MODS)的重要原因。因此，如何减轻严重烧伤后胃肠粘膜损伤，加速胃肠粘膜修复是目前烧伤救治中的重要问题。肠三叶因子(intestinal trefoil factor，ITF)是由肠杯状细胞特异分泌的小分子多肽，它的59个氨基酸序列中有一段特殊的核心结构域，其间的6个半胱氨酸按特定(1-5，2-4和3-6)的顺序，依次以二硫键两两相接，形成3个环状结构，整个肽链由此发生弯曲和折叠，形如“三叶草”，故名肠三叶因子(ITF)。ITF一经发现便受到广大学者的广泛关注，大量的研究表明，ITF在肠粘膜的自我保护及修复机制中占据重要地位。作为一个具有广泛应用前景的药物前体，却因为复杂的制备过程、较低的产量限制了它的应用。基因治疗是近年来出现的崭新的治疗手段，是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。若通过基因治疗的途径将ITF基因导入体内，可以使ITF在体内大量表达，有望简化繁琐的操作程序、降低昂贵的生产成本。腺病毒作为目前使用最为广泛的基因传递载体，具有众多优点：宿主范围广、安全、滴度高、多基因表达、稳定、外源基因容量大、可高水平介导外源基因表达、可感染增殖和非增殖细胞、与人类基因同源性以及免疫途径简便。经检索，目前国内外尚未发现关于构建包含hITF基因的腺病毒载体的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种重组腺病毒的制备方法及其用途，该重组腺病毒为包含hITF全长基因序列的腺病毒，将hITF基因与穿梭质粒(pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hITF；该重组腺病毒可以高效感染肠上皮细胞，表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移，作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。

本发明是以如下技术方案实现的：一种重组腺病毒的制备方法，它包含人肠三叶因子基因(hITF)的腺病毒，其特征是：将hITF基因与穿梭质粒(pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hITF。

所述的一种重组腺病毒的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

(1)hITF基因的获得：肠粘膜组织中总RNA的提取以及引物的设计；

(2)重组穿梭质粒的构建：含有hITF的信号肽与成熟肽序列，与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV具有相同的内切酶位点BglII、Not I，经相同的两种内切酶酶切后，两种质粒分别产生互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下，目的基因hITF与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV相连；

(3)重组穿梭质粒与骨架质粒同源重组：线性化的重组穿梭质粒加入到BJ5183感受态细菌，37℃过夜培养，挑阳性克隆摇菌、提质粒，Pac I酶切鉴定；

(4)重组腺病毒的包装：脂质体介导pAd-hITF质粒转染HEK293细胞，腺病毒的收集与扩增以及腺病毒的滴度测定(TCID50法)；

所述的重组腺病毒可以高效感染肠上皮细胞，表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移，作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。

所述的重组腺病毒在烧伤小鼠基因治疗胃肠粘膜损伤中的应用，首先制备30％TBSA III°烧伤小鼠模型；重组腺病毒灌胃，观察治疗作用。

本发明的优点是：传统的hITF治疗方法为，通过基因重组技术在体外制备hITF，其制备过程复杂、纯化手段繁琐、保存条件严格，且产量低下；本发明通过制备含有hITF基因的重组腺病毒，口服该腺病毒后hITF可以在胃肠道内源源不断的产生，无需制备、纯化及保存hITF，而且产量高。

附图说明

图1为RT-PCR产物电泳图；

图2为重组质粒酶切鉴定示意图：