[发明专利]一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法。是利用荧光染料5(6)羧基荧光素酯(CFDA)快速标记梨果实发育过程中来自源叶的光合产物在库器官内的卸载路径，属于植物细胞生理学的领域。

背景技术

梨是世界及中国主栽果树之一，也是我国出口创汇的传统果品，在我国除海南省之外的省(市、区)均有梨树栽培，并且是许多省份(如河北、江苏、安徽等)的重要水果之一，已经成为我国很多地方农村经济发展的支柱产业。据中国统计年鉴，截至2010年底，我国梨树栽培总面积有110.5万hm²，总产量1426.3万t，分别占世界梨总栽培面积和总产量的62％和64％以上，是世界上第一大产梨国家。

果实是梨树的经济‘库’器官，果实品质的优劣直接关系到梨产业能否在市场竞争中获得长足发展。来自源叶的光合产物以山梨醇和蔗糖的形态经韧皮部运输进入果实贮藏或进一步利用，不仅成为果实品质和其他营养成分及芳香物质合成的基础原料，而且可作为重要的信号分子参与果实发育相关基因的表达及整个植物源-库活性的调节，这一观点已被大家认同。高等植物中的物质运输主要在维管束中进行，而韧皮部则是其中负责同化物在体内运输的主要组织。库器官内的韧皮部同化物卸载的路径主要有共质体途径(symplastic)和质外体途径(apoplastic)。共质体途径是通过胞间连丝进行的，质外体途径则是跨膜运动，需要特异的载体介导和能量驱动。目前普遍认为，卸载路径在很大程度上决定了同化物从‘源’到‘库’的一系列转运过程，对卸出效率有着关键性的调控作用，最终影响到果实的品质。揭示果实发育过程中同化物卸载的路径，对于促进果实内糖的积累和转化，实现优质高产具有重要的理论意义和实践价值，越来越受到人们的重视。

梨果实中有发达的维管组织系统，除侧生心皮束外，其他主要维管束均位于薄壁组织内，这些维管束的分支遍及整个果肉，形成一种网结状系统，源源不断地为果实的生长发育提供必需的物质。长期以来，由于研究条件的限制，严重制约了人们对梨果实发育过程中韧皮部同化物卸载路径的认识。近年来，5(6)羧基荧光素酯(CFDA)作为一种比较理想的荧光示踪物质被用于不同类型库器官中同化物的卸载路径研究，通过放射自显影技术证明其运输方式同同化物的卸载方式相类似。其原理是：当CFDA被装载到细胞里，就会被内源酯酶分解成为有荧光信号的5(6)羧基荧光素(CF)，变成了膜不透性的共质体同化物卸载的荧光指示剂。通过在荧光显微镜下观察CF在库器官内的分布情况，就可以了解韧皮部同化物卸载的路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。

但是，我们以梨果实为研究材料时发现，在CFDA标记过程中，若通过其他作物上采用的电流注射法、压力注射法和显微注射法则需要专门的设备且技术要求高，而Eppendorf管棉线渐渗法和叶片涂抹法虽然不需要专门的设备，但操作过程繁琐、容易伤及木质部和韧皮部，且荧光染料溶液蒸发，都达不到理想的标记效果。为此，我们通过实验建立了一种更为有效的、可快速示踪梨果实韧皮部同化物卸载路径的荧光标记方法，获得了理想的结果，具有重要的实践应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，应用该方法可快速了解梨果实发育过程中来自源叶的光合产物在库器官内卸出的路径，具有操作简单、方便实用及结果理想等优点。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，包括以下步骤：

(1)配制1～2mg/mL荧光染料5(6)羧基荧光素酯(5(6)-carboxyfluoresein diacetate，CFDA)溶液；

(2)步骤(1)配制的CFDA溶液的引入：轻轻磨擦果柄表皮，不要伤及木质部→迅速将棉花团缠绕在果柄上→用封口膜将棉花团封好→采用微量注射器将配制好的CFDA溶液缓慢注入棉花，每个果实注入150～250μl上述配制好的CFDA溶液→立即用封口膜密封针孔防止溶液外渗→然后用锡箔纸将果柄部位覆盖好，防止CFDA见光分解；

(3)采样：经CFDA溶液处理48～72h后采摘果实；

(4)制备切片：将新鲜的经CFDA溶液处理过的果实，切取带有维管束的果肉组织块，然后切片，每完成一个切片用载玻片直接沾取切片，使切片平铺于载玻片的中央；

(5)观察拍照：制备好的切片，立即用荧光显微镜观察5(6)羧基荧光素(carboxyfluoresein，CF)在果实内的分布图像，防止荧光淬灭。