[发明专利]一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备。 

背景技术

肿瘤发病率逐年上升，传统的手术、放疗、化疗三大模式中，化疗是唯一的全身治疗手段，但化疗的有效率低（25-30%）、副反应大、耐药性、只对分裂期细胞有效、严重的免疫抑制、对肿瘤干细胞无效六大缺陷，严重限制了临床应用。“细胞免疫治疗”作为一种全新的全身治疗新技术应用于临床，并获得了有效率高、副反应小的良好效果，被越来越多的肿瘤病患所接受，因而成为肿瘤的第四大治疗模式。 

目前国内外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技术进行肿瘤的细胞免疫治疗，临床疗效虽远高于化疗，但回输的效应细胞在体内存留时间短，有效率低仍是目前亟待解决的瓶颈问题。 

基础研究证实，肿瘤一旦形成，就会形成“肿瘤微环境”，产生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-β、IL-6等，同时调节性T淋巴细胞（Treg）水平大幅升高，结果导致病人本身的免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，致使肿瘤无限制生长，我们称之为肿瘤的“免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要这些免疫抑制因素存在，体外制备的效应细胞回输体内后很快被抑制，体内的存留时间只有3-5天，严重影响了效应细胞对肿瘤的杀伤效应。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破肿瘤免疫耐受、提高免疫治疗疗效的关键。 

细胞免疫治疗方法很多，上世纪初就出现了应用LAK细胞治疗肿瘤的技术，但由于有效率低，疗效不确切而被放弃。以后，人们逐一探讨了NK细胞、TIL细胞、CTL细胞、DC疫苗等临床应用的可行性，均因疗效的不确切性而未被临床认可。本世纪初，人们发现DC-CIK细胞具有强大的肿瘤杀伤功能，并能在体内产生免疫记忆，有利于持续的免疫杀伤，而且副反应小、安全性高，因而国内外临床已广泛推广应用至今。 

DC-CIK技术的方法是：从肿瘤病人外周血获取单状核细胞，体外分离出DC细胞（贴壁）和T细胞（悬浮）。贴壁的DC细胞内加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集备用。悬浮的T细胞加入INF-γ冲击，然后加入CIK细胞因子，每48小时扩增一次。第5-7天，将成熟DC和CIK细胞混合培养8-10天获得DC-CIK，移至含有2.0g白蛋白的0.9%生理盐水中制备成DC-CIK效应细胞制剂，直接静脉输注治疗（参照专利200510112381）。上述方法存在的问题是：①效应细胞制剂肿瘤杀伤力强但特异性相对差；②直接回输后，在肿瘤微环境中IL-10、TGF-β及Treg的免疫抑制下，效应细胞在体内的存留时间短（3-5天），杀伤效率低；③所产生的免疫记忆也被抑制而不能发挥免疫激发功能，因而，临床疗效有限。 

本发明在于提供一种在干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受基础上，DC-CIK-CTL高效特异性细胞免疫治疗的新技术，解决了现有DC-CIK技术存在的特异性差、体内存留时间短、杀伤效率低等瓶颈问题。 

本发明的方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞经过INF-γ冲击后，应用CIK细胞因子扩增至第7天，半数移瓶加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数继续CIK扩增，至第10天收集CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml 0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，2次/日，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。 

本发明还发现，单次应用小剂量替加氟或环磷酰胺（CTX），能够有效的降低肿瘤病人外周血调节性T淋巴细胞（Treg）的比率，同时能够降低外周血中IL-10和TGF-β的量，但并不能有效的杀伤肿瘤细胞。因而我们假设，尽管小剂量CTX的应用不能起到治疗肿瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF-β含量，恰恰能够达到消除肿瘤微环境中重要的免疫抑制因素，在此基础上实施细胞免疫治疗，可以有效的延长回输的效应细胞在体内的存留时间，强化细胞免疫对肿瘤的杀伤效应，获的更高的临床疗效。 

基于以上发现，我们建立了本发明，即首先应用小剂量替加氟和CTX对肿瘤病人进行预处理，然后给予DC-CIK-CTL高效特异性杀伤细胞，进行细胞免疫治疗。经过实验室研究、动物实验研究及临床试验研究，获得大量研究数据，证实了该技术的有效性和安全性。