[发明专利]一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备

权利要求书

1.一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，外周血采集单状核细胞；

步骤2，DC和T细胞分离；

步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；

步骤4，CIK制备；

步骤5，CTL制备；

步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下：

应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，循环外周血6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清，得到自体血清，4℃冷藏备用；收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数；

其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下：

175cm²培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×10⁷个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞；

其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下：

贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml，IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml的无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，其中，自体肿瘤相关全抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm³，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量；次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗；

其中，步骤4的CIK制备的方法如下：

取175cm²培养瓶若干，分别加入含IFN-γ 1000U/ml，庆大霉素2万单位/500ml的AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的T细胞移入，置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养，次日，补充半量的CIK培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位），第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位），以后根据培养液颜色，每次补充40％以上的IL-2培养基，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养；

其中，步骤5的CTL制备的方法如下：

第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL；

其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备方法如下：

第10天分批取DC疫苗1-2×10⁷复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×10⁹的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×10⁹，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位的生理盐水瓶，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂，4℃环境保存。