[发明专利]聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法

说明书

技术领域

本发明为一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。

技术背景

熊胆因珍稀名贵，市场价格昂贵，市场常有以鸡、牛、羊、猪胆汁干燥加工成粉混充熊胆粉出售现象，掺假现象极为严重。熊胆粉掺假除影响药品本身质量外，更重要的是影响中药的疗效及配伍而给患者造成不良后果，所以熊胆粉及其制剂真伪的鉴别在实际中拥有重要的意义。由于中成药的组成及成分复杂，干扰因素多，用传统生药学方法鉴定其真伪及纯度有较大的难度。而DNA水平上鉴定打破了中药常规鉴定的界限，可以从生物的种或种以下水平进行准确地鉴定，不受组织或药材部位对鉴定的影响，因而对于准确、合理、安全用药、保障患者的权益具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有所存在的问题，提供一种分辨力强、重现性好的一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。

本发明的具体方法如下：

a、样品（熊胆粉与伪品）的基因组提取方法

取熊胆粉2克，伪品鸡、羊、牛、猪胆汁干燥品各2克，放入各自的试管中，采用酚-氯仿-异戊醇抽提方法对其基因组DNA进行提取。

b、用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物

上游引物：5'  CGCCATGAACCCTCCCTCTA  3'   

下游引物：5'  CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT  3' 

c、用于扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件

在反应体系中：取50ng/μl样品的DNA模板2μl，10倍缓冲液  2μl ， 2.5mM 的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2μl，上游引物：5'  CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3' 1μl，下游引物：5'  CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT  3'  1μl，聚合酶0.2μl放入试管中，用灭菌去离子水补充至25μl。

其扩增条件： 94.0℃ 8分钟；之后35个循环包括：94.0℃  1分钟 ，58.6℃  1分钟， 72.0℃  2分钟，最后72.0℃ 10分钟35个循环；得到聚合酶链式反应扩增产物。

d、聚合酶链式反应扩增产物的检测方法

在水平电泳槽中制备其浓度1.5%琼脂糖凝胶；将上述聚合酶链式反应扩增产物 5μl加入点样孔，在对比孔中加入5 μl分子量标准 2000型作为对比；电压120 V，电泳40min后在图谱成像系统中成像。

e、通过电泳图谱判断熊胆样品的真伪。

本发明的有益效果是

该方法不仅可以对来源相近的正品与混淆品进行区别，而且可以对干燥加工成粉熊胆粉进行鉴别。

熊胆粉是熊分泌物，很难由药材推逆原动物的品种与质量，而来源相近的正品与混淆品则更不易区分。因此，很多传统的中药鉴定方法无法解决目前许多动物类中药的鉴别问题。用本方法进行中药材DNA分子标记鉴别，只需取极少量的样品即可提得足够用于多聚酶链反应(PCR)扩增的DNA模板，然后进行鉴别判定。该方法速度快、分辨力强、重现性好，可以澄清熊胆及其粉剂的真伪和优劣（涉及剂量、比例），弥补传统中药鉴定中动物类中药鉴别的弱项，为临床合理用药提供科学依据。

该技术的运用是提高中药材的质量，保障千百万人民身体健康和生命的安危、保障中医疗效的基础；可以有效的遏制伪造、掺假、滥用、误用、混用等现象，提高中医药的信誉，保障人民用药安全，其经济效益不言而喻的。

附表： 熊胆粉与伪品扩增后的结果