[发明专利]黄曲霉毒素B1核酸适体及其应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力结合的黄曲霉毒素B1核酸适体及其应用。

(二)背景技术：

黄曲霉毒素(AF)是一组化学组成相似的真菌毒素的总称，属二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，包括毒素B1、B2、G1、G2等10多种，其中以黄曲霉毒素B1存在量最大，毒性也最强，主要产生菌种是黄曲霉和寄生曲霉，最常见于花生及粮油等花生制品、玉米、大米、棉籽、一些坚果类食品和饲料、奶制品中。AF有强烈的毒性，按毒性级别分类，属于超剧毒级，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。其作用的主要靶器官为肝脏，急性中毒主要表现为肝脏损伤、肝实质细胞消失延迟、胆管增生、肝细胞脂质消失延迟和肝出血，慢性中毒主要表现为生长发育迟缓、肝脏出现亚急性或慢性损伤，并引起原发性肝细胞癌，已成为人类肝癌发病的重要因素，还可作用于如肾脏、胃、直肠、乳腺、卵巢等器官。包括中国在内的许多国家均制定了食品中AF允许量的国家标准。

目前世界各国通用的AF检测方法为薄层层析法、微柱法、高压液相法等，这些方法均不同程度地存在操作繁琐、效率低、对操作者、操作环境要求较高的缺点，酶联免疫吸附法是国际公认的测定AF的先进方法，灵敏度高、干扰少、测定步骤简便、快速、操作安全。然而，对于AF这种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了酶联免疫吸附法等免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在AF这种毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景，其高度特异性(具有对靶标分子单个取代基修饰的识别能力)更特别适合于AF这种结构类似物复杂的分子分析。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供黄曲霉毒素B1核酸适体在黄曲霉毒素B1检测分析和样品分离富集中的应用方法，具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。

本发明的技术方案：一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于它为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物具有相同功能用途。

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于将黄曲霉毒素B1核酸适体用于黄曲霉毒素B1的检测分析，它包括以下步骤：

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①黄曲霉毒素B1核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200 OliGreen 100μl，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。