[发明专利]一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种与分子佐剂共表达的预防亚洲1型和A型口蹄疫蛋白工程疫苗的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将不同亚洲1型和A型口蹄疫主要外膜蛋白VP1和VP2多个B细胞抗原表位，杀伤性T细胞抗原表位(CTL表位)，多个T细胞辅助抗原表位(Th表位)与分子佐剂多肽(IFNα)串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到共表达的免疫效果增强型口蹄疫二价蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病口蹄疫中的应用。 

背景技术

口蹄疫是全球最重要的经济动物疾病之一。该病高度感染，通过接触或空气迅速传播。由于口蹄疫高度传染的特性，为了禁止引入口蹄疫和参加国家贸易，无口蹄疫国家对疫情国家保持严格的检疫和进口动物限制。 

在口蹄疫流行国家，对敏感家畜接种高效力、安全、成本有效地疫苗是控制口蹄疫的基本要求。口蹄疫可以通过动物卫生措施和疫苗接种进行控制，但是由于存在多种病原血清型，包括野生物在内的多种宿主和极端感染性，控制口蹄疫变得很困难。尽管现代集约化家畜养殖体系不允许口蹄疫发生，但是口蹄疫通常不致命，在许多发展中国家并不优先控制，这就为口蹄疫的传播留下了传染源。较好的诊断方法尤其是较好的疫苗能显著的提高世界上无口蹄疫国家和部分疫情国家的控制能力。特别是，高热稳定性和长免疫期的疫苗将有助于控制疾病，减少对先进兽用基础设施的依赖(David J.Paton et al，2009)。人类有意识并试图控制口蹄疫可以追溯到几个世纪以前，Loeffler and Frosch研究表明口蹄疫病毒是第一个哺乳动物病毒病病原(Blancou，2002)。 

全病毒灭活苗是传统的用于口蹄疫控制计划疫苗，在控制疫病方面取得了巨大的成功。然而，与目前疫苗有关的问题包括对生产疫苗病毒高防护设备的要求，发生抗原变异导致的众多血清型和血清亚型，以及疫苗不能快速的产生免疫保护力，如果病毒灭活不彻底或者减毒不充分，就会引起口蹄疫暴发增加等，促使研究人员去开发更有效的疫苗，为病毒感染早期阶段提供更好的保护。 

合成口蹄疫疫苗将消除传统疫苗制备过程中病毒处理的各方面的不足，免疫接种合成疫苗被视为是最理想的选择。目前所设计的和正在研究的诸多基因工程疫苗仍存在许多问题和不足。在许多疫苗设计的抗原成分中仍含有大量与特异性免疫诱导无关的成分，如免疫抑制 和自身免疫等免疫病理成分，而这些成分正是引起局部或全身不良反应的重要因素。 

有学者单克隆抗体技术研究了VP1的多个抗原位点，更进一步的抗原位点来自VP2和VP3。因此，所有的口蹄疫病毒衣壳蛋白编码序列都值得关注(Reddy G R，1999；Stram Y，1994)。VP1蛋白成为相当多的研究和结构分析的首选蛋白，已经发现VP1能够引起猪体内中和抗体反应，并且能够保护猪和牛免受FMDV的感染。Kleid D.G.(1981)等报道了生物合成融合多肽TRP LE和VP1多次免疫保护牛和猪能够抵抗FMDV攻毒。对应FMDV VP1多肽141-160和200-213区域化学合成了多肽表明这些肽能够使豚鼠和兔产生高水平中和抗体(WO8303547，1983)。 

有学者对已有的口蹄疫病毒分离株进行了序列对比发现：亚洲1型分离株的核衣壳蛋白编码序列均观察到密码子变化，但是编码VP1蛋白的变化频繁，编码VP4蛋白的很少变化(Acharya R et al，1989；Lea S et al，1994)。VP1构成病毒表面的大部分，很多氨基酸替换部不会损害结构限制，而VP4位于病毒粒子内部，由于受到结构限制，氨基酸序列在型间是保守的。但是亚洲1型VP4蛋白偶尔缺少第6或第7残基，这一点与A、O和SAT型口蹄疫不一致(Reddy G R，1999；Stram Y，1994)。