[发明专利]一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水环境监测、水生态学、微生物有害代谢物等领域，更具体涉及一种采用PCR(聚合酶链式反应)和荧光定量PCR对环境中的产2-MIB蓝藻进行检测的方法，适用于对水库、湖泊和河流等饮用水源地及水生态系统中的藻源性2-MIB进行预警和快速定性、定量。

背景技术

近年来，随着水体富营养化的日益加重，蓝藻水华在全球尤其是我国大面积爆发。水华问题已经成为我国环境保护领域所面临的重大问题。蓝藻水华的危害表现在很多方面，其中对人类健康和饮用水有直接威胁的藻毒素问题已经受到了极大的关注。除各种藻毒素外，很多蓝藻种类还分泌具有异味的挥发性次生代谢产物，使水体和水产品产生令人反感的嗅味。水体异味问题不仅大大降低了饮用水的水质，还对渔业、生态景观和旅游业等造成了巨大的损失。由蓝藻所引起的藻源性异味次级代谢产物和藻毒素一起已经成为全球普遍存在的严重的环境问题。近年来，随着对异味问题的重视，已经有越来越多的水体异味问题的报道，其中对社会经济造成极大影响的当属2007年太湖饮用水危机。

具土霉味的萜类化合物2-MIB(2-甲基异茨醇)被认为是引起各种淡水水体异味问题的主要原因之一。作为富营养化水体中重要的生物类群，蓝藻通常被认为是2-MIB合成和释放的主要生物类群。通过传统的形态学观察等方法一般并不能有效地区分蓝藻是否产2-MIB。申请者最近的研究成果表明，在蓝藻中2-MIB是由一个基因簇(含有一个甲基化酶基因和一个单萜环化酶基因)调控合成而来，只有具有此基因簇的蓝藻藻株才能够产生2-MIB。目前，多种基于基因的产毒蓝藻的分子检测方法已经建立，而关于产2-MIB蓝藻的分子检测方法尚未有报道。由于具有简便、快捷、高灵敏度等优势，基于PCR的分子方法对产2-MIB蓝藻的鉴定具有独特的优势。

传统的水环境中2-MIB浓度的检测主要基于气象色谱-质谱联用的化学分析技术，这类技术虽然能准确定量浓度，但是其缺点在于相对繁琐、昂贵，并且具有一定的检测限。在水体中2-MIB的主要浓度主要由具2-MIB合成能力的蓝藻的生物量决定。从分子生物学的角度来看，水体中2-MIB合成基因的拷贝数在一定程度上最终决定了2-MIB的浓度。普通的PCR检测技术可以定性检测蓝藻是否产2-MIB和环境中是否有产2-MIB蓝藻，不能定量检测水体中产2-MIB蓝藻的浓度。因此，开发一种基于2-MIB合成基因-单萜环化酶基因-的定性PCR和基于分子探针(TaqMan)的实时荧光定量PCR检测技术快速、高灵敏度的定性和定量环境中产2-MIB蓝藻的浓度对水质监测和预警具有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的水体异味监测需求，是在于提供了一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法，方法易行，操作简便，TaqMan qRT-PCR具有很高的灵敏度和准确度，可以快速、准确的定量水样中产2-MIB蓝藻的浓度，能够对环境中或纯培养的产2-MIB蓝藻定性和定量，可用于对各类富营养化淡水水体中具2-MIB产生能力的蓝藻进行快速定量。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

采集环境样本(水样)并提取基因组DNA，采用分子信标荧光定量PCR(TaqMan qRT-PCR)的方法对2-MIB合成相关单萜环化酶基因片段进行定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算单位体积样本中单萜环化酶基因的拷贝数和产2-MIB蓝藻的浓度。

一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法，其步骤如下：

1、采集一定体积(300-1000ml)的待测水样，经0.45μm的醋酸纤维素膜过滤，将过滤到的藻进行总基因组DNA的提取和纯化。将提取到的DNA溶于一定体积(30-50μl)的无菌双蒸水中，置-20℃保存。

2、定性PCR的反应体系为：2×PCR反应体系(Mix)10μl，特异性扩增2-MIB合成相关单萜环化酶基因的正反引物各1μl，待检测的DNA 1μl，以双蒸水校正至20μl体积。所用引物为：CITf(5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3)，CITr(5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3)。以产2-MIB蓝藻DNA为阳性对照，双蒸水为阴性对照。

3、定性PCR的反应程序为：94℃预变性3min，接着40个循环，每个循环94℃30s、58℃30s和72℃30s，循环过后最后72℃延伸5min。