[发明专利]5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原及其制备方法与应用。

背景技术

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸途径的关键酶。近年来，由于除草剂草甘膦的广泛使用，及其非选择性的特点，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦基因作物成为热点。CP4-EPSPS作为该类备选基因，已成功应用于多种商业化抗草甘膦转基因作物。

中国政府对转基因作物的安全性极为关注，并制定了有关法规。但由于我们目前未开展转基因抗除草剂草甘膦方面的研究，也没有建立对国外进口植物是否为转基因抗除草剂商品进行检测的体系，所以还待开发转基因EPSPS蛋白的检测方法。免疫检测技术已被广泛应用于毒素、杀虫剂、炸药等的环境污染和危险物的检测，与其他检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏和特异的优点，可便携进行现场检测。免疫检测试剂盒可以快速检测某一特定物质的含量，但要将免疫分析法应用到检测转基因EPSPS蛋白，必须制备相应的抗原和抗体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原的方法。

本发明所提供的制备5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原的方法，包括如下步骤：

(1)将载体蛋白与双功能试剂进行反应，得到反应产物I；所述双功能试剂选自4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸盐或N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯；

(2)将所述步骤(1)得到的反应产物I与序列表中序列1所示的多肽进行反应，得到反应产物II，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原。

所述步骤(1)中所述载体蛋白与所述双功能试剂的投料摩尔比为1∶10-1∶20或1∶10或1∶15或1∶20；

所述步骤(2)中所述反应产物I与所述多肽的投料摩尔比为1∶10-1∶20或1∶10或1∶15或1∶20。

所述步骤(1)中所述反应的温度为20℃-25℃或20℃或23℃或25℃，所述反应的时间为1h-3h或1h或2h或3h。

所述步骤(2)中所述反应的温度为20℃-25℃或20℃或23℃或25℃，所述反应的时间为10h-20h或10h或15h或20h。

所述步骤(1)中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

所述步骤(1)中在得到所述反应产物I之后，还包括以下步骤：

将所述反应产物I进行凝胶过滤层析，用0.01M PH7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集OD₂₇₈为1.5-3.0的洗脱液，即得到纯化的反应产物I；所述凝胶过滤层析的介质为Sephadex G-25。

所述步骤(2)中还包括将所述反应产物II进行透析，得到纯化的反应产物II的步骤。

根据所述方法制备得到的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原也属于本发明的保护范围。

由所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。

所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原和/或所述抗体在鉴别转5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的制备EPSPS多肽抗原的方法能够方便、快捷地获得EPSPS多肽抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的EPSPS多肽抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。因此，本发明所提供的制备EPSPS多肽抗原的方法以及由该方法获得的EPSPS多肽抗原，将在EPSPS蛋白的酶联免疫检测中有广阔的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。