[发明专利]一种造血嵌合体实时定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种利用荧光染料SYBR green来进行造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.收集标本；

S2.选择多态性遗传标记设计引物和探针(probe)；

S3.实时定量PCR检测造血嵌合体；

S4.人工合成不同稀释浓度的造血嵌合体；以及

S5.统计学分析。

2.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S1中，包括：

通过临床采集供体和受体移植之前和移植后一个月的血样；

用常规方法从中直接提取基因组DNA；以及

用分光光度仪测量DNA浓度，而后保存备用。

3.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S2中，选择多态性遗传标记设计引物和探针(probe)的选择标准为：包括含有至少两个以上连续的碱基不同的等位基因多态性。

4.如权利要求3所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S2中，进一步包括以此标准选择12个多态性遗传标记。

5.如权利要求4所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S2中，进一步包括用软件Prime 3来设计引物，针对每个等位基因多态性标记，需要设计两对引物，其中一个针对两个等位基因的共同位点，一个针对独特的多态位点。

6.如权利要求5所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，进一步的，使用的TaqMan probe探针被选定在两个等位基因之间；然后对每个PCR产物进行熔解曲线分析。

7.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述实时定量PCR检测造血嵌合体的步骤S3中，进行利用SYBRgreen和TaqMan probe的实时定量PCR检测，每个反应20微升，在Rotor gene3000荧光定量PCR仪中进行。

8.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述步骤S4中，是利用供体DNA来稀释受体DNA或受体DNA来稀释供体DNA进行人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体。

9.如权利要求8所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，所述人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体的浓度从0.01％至100％。

10.如权利要求8所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法，其中，还包括同时运行熔解曲线验证PCR产物的特异性。