[发明专利]一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生态环境保护领域，主要涉及一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法。

背景技术

转基因作物的研制与应用是提高我国农业生产效率、有效解决我国的粮食安全问题的重要途径。转基因作物的释放与规模生产对农业生态环境可能产生一定的影响，客观评价转基因作物对农业生态环境的可能影响是转基因作物研究和发展的重要基础和现实问题。

土壤是农业生产的载体，转基因作物种植与土壤生态系统间将发生一系列交互作用，转基因作物的外源基因及其表达产物可通过多种途径进入土壤生态系统，其中最直接的途径有：1)根系分泌物：转基因作物根系表达的毒素蛋白和根系分泌物不断地向作物根际周围土壤释放外源基因及其表达产物；2)作物残茬：转基因作物的外源基因及其表达产物可通过收割前后遗留在田间的根茬和残枝落叶等进入土壤；3)转基因作物花粉的散布使外源基因逃逸并进入土壤。

转基因作物的外源基因及其表达产物进入土壤，与土壤微生物接触，对其产生不同程度的影响。研究表明转基因作物种植会对某些特定的微生物发生影响，如抗草甘膦大豆的种植会促进大豆根腐镰刀菌(Fusarium spp.)的生长和定殖，使该转基因大豆品种的应用受到一定的制约。转Bt基因水稻(克螟稻)秸秆还田对水田土壤反硝化细菌和产甲烷细菌种群有显著的抑制作用，对厌氧发酵细菌种群有显著的刺激作用，对厌氧固氮细菌种群有轻微刺激作用。特定微生物的改变将反映在土壤微生物结构和功能上的变化，如，转基因油菜根际微生物组成的差异导致转和非转基因油菜品种根际微生物在碳素利用方式和脂肪酸甲基酯图谱方面明显不同。已知多种作物的多个转基因品系及其残体可以改变土壤微生物群体的组成，但这些改变也同时受检测技术、田间土壤性状、季节变化等的影响。因此，准确检测转基因种植土壤微生物变化是评估转基因作物释放生态风险的重要基础。

发明内容

本发明提供了一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，为转基因水稻对土壤生态系统安全评估提供技术手段。

一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，包括：

(1)分别采集转基因水稻在分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期的根际土壤，将根际土壤在20-30℃下风干，过2-3mm筛后溶于缓冲液，得到混合液；

(2)提取混合液中微生物的总DNA，以该总DNA为模板，PCR扩增所述微生物的16SrDNAV3片段，扩增产物经温度梯度凝胶电泳分离，染色得到所述微生物的DNA指纹图谱；

(3)对各生长阶段转基因水稻根际土壤微生物的DNA指纹图谱进行分析，得到转基因水稻根际土壤微生物的结构变化情况。

所述的温度梯度凝胶电泳采用的凝胶溶液为放置30天后的聚丙烯酰胺凝胶溶液。

所述的温度梯度凝胶电泳的条件为：电压160-200V、温度42-50℃，电泳时间3-4h。

所述的提取混合液中微生物的总DNA的方法为：采用FastPrep核酸提取仪和FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒提取。

所述PCR扩增所采用的正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明检测方法操作简便，TGGE图谱条带丰富，检测的土壤细菌完整性强，且有效克服了土壤腐殖质的干扰，能够对转基因水稻根际土壤微生物结构变化做出准确测定。

附图说明

图1为华池B6、嘉早935、中九B种植期间不同生长期的土壤样品16S rDNA V3区TGGE指纹图谱，其中，1-3泳道为华池B6，4-6泳道为嘉早935，7-9用到为中九B；A分蘖期，B抽穗期，C灌浆期，D成熟期；

图2为华池B6、嘉早935、中九B第一年种植期间不同生长期的土壤样品16S rDNAV3区TGGE指纹图谱主成分分析图，其中：A分蘖期，B抽穗期，C灌浆期，D成熟期。

具体实施方式

水稻材料

Bt水稻华池B6、亲本嘉早935和远缘亲本中九B

田间试验与采样

田间实验在浙江省建德市苗木基地进行，试验田划分为9个小区，分别种植这三个水稻品种，每个品种均设3个重复小区，每个小区26-28行×12株/行≥300株，不同品种的小区间隔设置。