[发明专利]Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种Q热贝纳柯克斯体检测方法，具体地说，涉及一种Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法。

背景技术

Q热(Q fever)是由贝纳柯克斯体(Coxiella bumetii)感染所致的一种人兽共患的自然疫源性疾病，该病被国际动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。

贝纳柯克斯体(Coxiella bumetii)是Q热的病原体，也是重要的生物战剂和生物恐怖剂，其主要通过呼吸道以气溶胶形式进入体内引起人和动物感染。Q热一般无特异性临床症状，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于Q热感染的早期诊断。由于贝纳柯克斯体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对贝纳柯克斯体病原进行分离。贝纳柯克斯体病原分离操作复杂，费时费力且成功率低。

聚合酶链式反应(PCR)是上个世纪90年代发展起来的一种简便、敏感、特异的检测病原体的分子生物学检测方法，也在Q热贝纳柯克斯体感染诊断中应用。目前，贝纳柯克斯体的快速检测与鉴定主要方法有Maurin，M.和Raoult，D.的PCR法，研究者根据16S rRNA、IS1111a以及com1、sod与16S rDNA特异性基因设计引物，广泛应用于PCR检测哺乳动物、节肢动物及患者等各种标本的Q热病原体。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另外，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

实时荧光定量PCR最突出的优点就是可以对核酸样品进行精确定量。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer(PE)公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20～24bp左右的寡核苷酸探针的5′端标记荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记荧光淬灭基团(Quencher，Q)，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7～10nm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5′-3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。常用的荧光报告基团有FAM、JOE、HEX、Texas-Red等，淬灭基团有TAMRA，Eclipse等。

由于采用了荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以彻底，本底较高。针对此问题，2000年美国ABI公司推出了一种新的TaqMan-MGB探针。探针3’端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。同时探针上还连接有MGB(minor groove binder)修饰基团，可以将探针Tm值提高10℃左右。使得较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。另外，较短的探针也降低了成本，还使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。