[发明专利]抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的动物转基因技术方法，属于细胞工程领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1.1％；2005年我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。

目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始探索防控FMD的新策略，RNAinterference(RNAi)因快速、特异的抗病毒能力而成为新的研究热点。

表达针对病毒不同基因的RNAi可切断病毒复制的源头，进而阻断病毒感染及其扩散和传播，将打破传统的通过免疫学手段预防病毒病的思维模式，为控制和消灭家畜病毒病开辟新的途径。RNAi是抑制病毒增殖的理想工具，其抗病毒功能在HIV(Chang等，2005；Das等；2004；Dave和Pomerantz，2004；Wu等，2007)、HBV(Wu等，2005；Wu等，2007)、埃博拉病毒(Geisbert等，2006)、脊髓灰质炎病毒(Gitlin等，2005)等病毒病的防控中进行了广泛的研究，并得到了验证。

许多学者针对FMDV不同基因并在细胞、实验动物及敏感动物猪等不同水平对RNAi抗FMDV作用进行了探索和研究，目前的研究结果如下：Liu等(2005)体外合成针对FMDV基因组5’NCR、VP4、VPg、3D和3’NCR保守区的siRNA可抑制同种及异种FMDV在BHK-21细胞内的增殖，病毒感染48h后的抑制率为10-1000倍，其特异性的抑制作用可持续6天以上；该研究以多基因交叉保护的方式抑制了FMDV在BHK-21细胞内的复制，为高度变异的FMDV的防控提供了新的策略。de los Santos等(2005)构建了针对4种血清型2B基因保守区的shRNA表达质粒，转染猪细胞后，可明显抑制病毒RNA及蛋白的合成，并减少了病毒的产率，该shRNA抗病毒作用是其序列特异性的，并不是诱导产生的干扰素导致的。Kahana等(2004)针对FMDV所有血清型3B和3D基因的保守区设计并合成了3个siRNA，共转染BHK-21细胞后，病毒在细胞内的增殖被100％的抑制。Kim等(2008)在FMDV感染前，接种表达siRNA的腺病毒有效地抑制了FMDV在猪IBRS-2细胞内的增殖，若在FMDV感染前和感染后均使用siRNA，其抗病效果更理想。Lv等(2009)利用T7RNA聚合酶体外合成的3个siRNA可特异性地沉默VP1-EGFP融合基因在293细胞内的表达；瞬时转染的siRNA可抑制FMDV在BHK-21细胞内的增殖。Pengyan等(2008)针对7个血清型的3D和2B1基因的siRNA/shRNA可减少FMDV在BHK-21细胞内的生长滴度；颈部皮下注射shRNA表达质粒后，FMDV对乳鼠的攻击减弱。Joyappa等(2009)将表达针对3D基因的shRNA的质粒转染BHK-21细胞后，用10²TCID₅₀的FMDV攻毒，与对照组比，病毒生长滴度下降3倍；用该质粒接种豚鼠后，对10³GPID₅₀的FMDV攻毒保护率为80％。Chen等(2004)转染针对VP1的shRNA重组表达质粒，可使FMDV VP1在BHK-21细胞内的表达下降80-90％，进而特异性地抗病毒感染，其抗病毒作用可持续48h；皮下注射该质粒的乳鼠对FMDV的敏感性显著下降。Chen等(2006)利用表达针对3D基因siRNA的复制缺陷型的人5型腺病毒阻止同种和异种FMDV对猪IBRS-2细胞的感染，并显著地降低了豚鼠及猪对FMDV感染的敏感性。Cong等(2010a)构建了可针对VP1基因的不同靶点的siRNA表达质粒，在BHK-21细胞内其对A、O和Asia I型VP1的表达具有沉默作用，并可抑制O型和Asia I型病毒的增殖；颈部皮下注射其可明显地降低乳鼠对O型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21细胞病毒感染及乳鼠攻毒保护试验，筛选出针对3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDV RNAi；在豚鼠的攻毒保护试验中，携带p3D-NT56的Salmonella choleraesuis C500减毒疫苗株(p3D-NT56/S.cho)对RNAi同种的FMDV的攻毒保护率为80％；预先接种p3D-NT56/S.cho剂量为5x10⁹CFU的猪，在FMDV攻毒后9天内的保护率为100％。上述研究结果表明，RNAi是控制高传染性FMDV在家畜中传播的可选择的具有潜力的策略。