[发明专利]一种埃博霉素B的发酵生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于埃博霉素B的生产技术领域，涉及一种埃博霉素B的发酵生产工艺。

背景技术

埃博霉素B(Epothilone B)是粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一种聚酮次级代谢产物，它与临床上广泛应用的抗肿瘤化疗药物紫杉醇具有相同的稳定微管活性，且对紫杉醇耐药的肿瘤细胞具有活性。另外埃博霉素来源于微生物代谢产物的特征使其被人们认为是一种比紫杉醇类药物更具市场前途的抗癌药物。

埃博霉素的发现可以追溯到上世纪八十年代德国国家生物技术研究中心(GBF)的微生物学家对土壤中粘细菌的大量研究工作。1987年他们在寻找抗真菌药物时发现了一株粘细菌(Sorangium cellulosum So ce90)能产生一类具有微弱抗真菌活性的大环内酯类化合物，命名为Epothilone(埃博霉素)。当时这个化合物并没有引起研究人员的重视。1995年默克实验室的研究人员发现了埃博霉素具有和紫杉醇类似的促微管聚合活性。从此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更简单的结构，对紫杉醇抗性肿瘤细胞的高活性以及可以通过微生物发酵制备而迅速成为继紫杉醇之后发现的促微管聚合化合物中最令人兴奋的研究热点。目前诺华、施贵宝、默克、罗氏等大型跨国制药公司都在埃博霉素药物的临床研究上投入了大量的人力物力，美国FDA于2007年10月16日批准施贵宝公司的埃博霉素产品(Ixabepilone，BMS-247550，IxempraTM，“伊沙匹隆”)单用或与卡培他滨合用治疗对其他化疗药物无效的转移性或局部晚期乳腺癌。预期未来将有多种埃博霉素药物上市。

与临床研究相比，埃博霉素的生产技术远远落后。其主要的瓶颈在于发酵产量低，粘细菌发酵制备埃博霉素的产量仅在mg/L发酵液水平。其中有两个重要原因，第一是埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大程度导致埃博霉素发酵产量很难提高；第二个导致埃博霉素生产成本高的原因是发酵结束后产物中存在大量埃博霉素同系物，导致目标产物分离纯化成本非常高。如何提高埃博霉素的发酵产量，降低生产成本成为目前埃博霉素药物研发的一个重要方向。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种埃博霉素B的发酵生产工艺，提高埃博霉素B的发酵生产能力，降低生产成本。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种埃博霉素B的发酵生产工艺，包括以下步骤：

1)按100ml接种1～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)接种于发酵液中，然后加入菌种质量100～800倍的特异性吸附埃博霉素B的分子印迹聚合物，在25～35℃下摇床发酵96～192h；

2)发酵完成后，分离并收集发酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印迹聚合物，然后用甲醇多次萃取，将埃博霉素B从分子印迹聚合物中分离出来，分别收集含有埃博霉素B的甲醇和分子印迹聚合物。

所述的发酵液中含有黄豆粉20～50g/L、玉米淀粉5～10g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO₄·7H₂O 2～5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L、CaCl₂ 2～5g/L、MnCl₂ 0.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L，pH为7.2～7.5。

在发酵培养时还进行葡萄糖的补加：在发酵培养的第1～48h每隔30min按每100ml发酵液加入0.05～0.2g葡萄糖的比例补加，在第48h至发酵结束每隔10～15min按每100ml发酵液加入0.1～0.4g葡萄糖的比例补加。

所述的发酵液中还含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一种，其含量为5～10g/L；

所述的发酵液中还含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、黄豆粉、KNO₃、NH₄SO₄中的一种作为氮源，氮源的含量为2～8g/L。

所述的分子印迹聚合物的制备为：

按照埃博霉素B：功能单体∶交联剂∶引发剂∶溶剂＝1∶(2～6)∶(20～30)∶(0.6～1)∶(3～20)的摩尔比，将上述反应原料加入到反应容器中，在保护气氛下超声振荡20～30min，在搅拌下通入氮气20～30min；然后在45～55℃下聚合反应12～24h，再在55～65℃下聚合反应8～12h；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40～60μm的聚合反应物；