[发明专利]在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法

说明书

一种在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于用黄嘌呤或氧嗪酸等竞争性抑制剂，在碱性硼酸盐或磷酸盐缓冲液中用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶，可用但不限于用聚乙二醇单甲醚的丁二酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚的碳酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚甲磺酸酯、聚乙二醇单甲醚醛；所用竞争性抑制剂浓度要达到其抑制常数1倍以上，所用活化聚乙二醇要达到待修饰尿酸酶中氨基摩尔总量的6倍以上才有明显保护作用；在竞争性抑制剂保护下聚乙二醇修饰后保留的尿酸酶活性可显著提高。

发明的技术领域

本发明涉及用尿酸酶竞争性抑制剂结合在尿酸酶活性中心后，降低活性中心必须氨基或酚羟基同针对氨基的活化聚乙二醇反应活性，从而保护尿酸酶避免其在被聚乙二醇修饰时失活的方法；该方法主要用于制备聚乙二醇修饰的尿酸酶作为药用尿酸酶原料。

发明的技术背景

尿酸酶是治疗痛风、肿瘤溶解综合症的特效药物，并可用于慢性肾脏病治疗；尿酸酶的这类应用都需要将其进行聚乙二醇(PEG)修饰制剂，以降低其免疫原性并延长其体内循环半衰期。Pegloticase是猪尿酸酶重组体经mPEG_10k修饰制得，临床主要用于治疗顽固性痛风^[14]。

尿酸酶进行聚乙二醇修饰时常用活化聚乙二醇修饰其氨基(附图1)；为减少修饰异构体并尽可能完全修饰封闭其免疫原性位点，需用大量活化PEG针对其氨基完全修饰。这类活化PEG也可同尿酸酶的酚羟基反应；这种针对尿酸酶氨基的活化PEG修饰过程会造成尿酸酶活性下降，甚至完全失活。所以，如何提高PEG修饰后尿酸酶的活性是一个技术难题。

提高酶蛋白质PEG修饰后活性的关键是保护活性中心及附近氨基酸残基不被修饰。通过定点突变改造将可修饰的必须氨基酸残基改成不能反应的残基并保留活性，是避免修饰后尿酸酶活性下降的有效方法之一；但其技术难度大，而且不明确尿酸酶的结构功能关系时难以实施。曾报道对尿酸酶进行PEG修饰时用底物尿酸可提高修饰尿酸酶的活性；但修饰过程中尿酸酶作用下尿酸很快被消耗而失去保护作用。尿酸的竞争性抑制剂也结合在活性中心但不会被尿酸酶作用而消耗，故能更好保护尿酸酶避免针对氨基的活化PEG修饰时失活。

发明概述

本发明的核心思想是碱性条件下用针对氨基的活化PEG修饰尿酸酶时，用尿酸酶的带负电荷的竞争性抑制剂结合在尿酸酶的活性中心，改变活性中心及其附近必须氨基或酚羟基的构象或相互作用状态，使其同针对氨基的活化PEG的反应活性显著下降，从而降低必须氨基及酚羟基被这类针对氨基的活化PEG修饰的比例而避免该尿酸酶在活化PEG修饰过程中失活，提高所得PEG修饰尿酸酶相对于未修饰尿酸酶的活性比例。

本发明所述提高针对氨基的活化PEG修饰后尿酸酶活性的方法，可用于天然尿酸酶和重组表达的尿酸酶；应用中所需要的针对氨基的活化PEG，可参照文献方法自主合成，也可从国内的北京凯正生物工程发展有限责任公司(www.kaizhengbiotech.com)、北京键凯科技有限公司(http://www.jenkem.com/cn/)购买。本发明应用中的特征在于按如下步骤进行：

(一)、将各种方式活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇；按所用活化聚乙二醇平均分子量和质量计算所用活化聚乙二醇的摩尔量；按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量的尿酸酶中氨基的摩尔量；

(二)、将浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.5～9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.0～8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到30分钟；当所用缓冲液体积很大时搅拌缓冲液以快速达到所需温度；如用活化的聚乙二醇羧酸酯，如丁二酸衍生物酯，则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度；如用活化的聚乙二醇的碳酸酯，则缓冲液pH控制在7.5到8.5间且温度控制在不高于20度；