[发明专利]一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽用生物制品,特别是涉及一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

目前国内生产猪瘟活疫苗的方式主要有脾淋疫苗(动物组织法)、细胞疫苗。细胞疫苗又分为原代（牛睾丸细胞）和传代（猪睾丸细胞）两种细胞生产方式。脾淋疫苗的免疫保护力要好于细胞疫苗，但一只兔子仅能生产500头份效力不低于100 PD₅₀的猪瘟疫苗。仅在中国，每年的猪瘟疫苗的市场容量不低于14亿头份，这相当于需要280万只兔子来制备这些疫苗，如此庞大的数量，是不可能实现的。所以，细胞疫苗是未来生产猪瘟活疫苗的发展方向。目前，前面提到的两种细胞均可用于猪瘟活疫苗的生产。当采用牛睾丸原代细胞生产时，存在一种外源病毒BVDV的感染风险，一旦牛睾丸原代细胞感染BVDV，将极大影响猪瘟活疫苗的质量；另外，牛睾丸原代细胞的制备来源很受限制，它需要从活体组织上获取。由此，传代细胞更适合猪瘟活疫苗的生产。近年来，利用猪睾丸传代细胞生产猪瘟活疫苗已在国内得到了广泛的应用，其生产用细胞主要采用转瓶培养，当大规模生产时，需要大量的人力和物力，生产效率低；细胞在转瓶内生长和产毒时，营养供应、环境pH、培养基内含氧情况都不能及时调整，转瓶内的细胞密度只有0.5～1×10⁶个/ml，这些都会影响疫苗的质量和产量；由于每瓶内细胞状态不尽相同，进而导致产品的均一性很差，从而造成疫苗产品的质量水平有较大的波动。这些都不利于优质、高效地生产猪瘟疫苗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，为了能够优质、高效地生产猪瘟疫苗，而提供一种创新的猪瘟活疫苗生产方式，即采用微载体高密度细胞培养技术，通过生物反应器高效生产猪瘟活疫苗的方法。本发明选用了一种完全不同的传代细胞系，小型猪肾细胞（MPK）。经驯化，猪瘟病毒可以很好地在该细胞系内快速增殖；由于该细胞系为猪源细胞，所以可降低疫苗注射后异源蛋白引起的不良反应；同时该细胞系生长时对营养条件要求不十分苛刻，因而适合大规模、高密度培养。本发明由于采用微载体高密度细胞培养技术，可使细胞密度达到8～16×10⁶个/ml，由此得到的病毒培养液的收获量与转瓶培养相比可提高20～40倍，因此显著提高了猪瘟活疫苗的生产效率和产量，同时也降低了生产成本，减轻了疫苗的副反应，还增强了疫苗生产的批次稳定性，得到了更为安全和有效的猪瘟活疫苗。

为了达到本发明的目的，本发明给出的技术解决方案是: 这种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特点是将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的营养培养基经连续灌注的方式加入生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，由此得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗，具体步骤为：（1）将MPK细胞在转瓶内扩增；（2）经转瓶培养得到足量的细胞后，接种到装有微载体的生物反应器中开始高密度细胞增殖培养；（3）当反应器内细胞密度增长稳定后，接种猪瘟病毒;（4）在接种病毒后第三天，开始连续收获反应器内的病毒培养液，收获期维持25～35天；（5）收集到的病毒培养液，经澄清、浓缩，加入稳定保护剂和pH缓冲液配制成疫苗原液，再将原液分装，经冷冻干燥得到猪瘟活疫苗成品。

本发明提及猪瘟病毒的细胞感染毒株为来源于中国兽医药品监察所的猪瘟兔化弱毒株，属于现有技术。

本发明提及的MPK细胞为Minipig Kidney Cell，是一种传代贴壁细胞系。经对微载体的贴壁适应性驯化，得到适应在微载体上贴壁生长的特异性MPK细胞。

为更好的实现本发明的目的，使用的微载体为NBS公司的Fibra Disk、GE公司的Cytodex 1和Cytodex 3中的一种；使用的生物反应器为NBS公司带有CELL LIFT IMPELLER 和 DECANTER的细胞培养罐，或者是NBS公司带有BASKET的细胞培养罐中的一种。