[发明专利]一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法

权利要求书

1.一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的营养培养基经连续灌注的方式加入生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，由此得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗，具体步骤为：

（1）将MPK细胞在转瓶内扩增；

（2）经转瓶培养得到足量的细胞后，接种到装有微载体的生物反应器中开始高密度细胞增殖培养；

（3）当反应器内细胞密度增长稳定后，接种猪瘟病毒；

（4）在接种病毒后第三天，开始连续收获反应器内的病毒培养液，收获期维持25～35天；

（5）收集到的病毒培养液，经澄清、浓缩，加入稳定保护剂和pH缓冲液配制成疫苗原液，再将原液分装，经冷冻干燥得到猪瘟活疫苗成品。

2.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的微载体为NBS公司的Fibra Disk、GE公司的Cytodex 1和Cytodex 3中的一种。

3.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的生物反应器为NBS公司带有CELL LIFT IMPELLER 和 DECANTER的细胞培养罐，或者是NBS公司带有BASKET的细胞培养罐中的一种。

4.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于所述步骤（1）、（2）中使用的细胞生长培养基是经过优化的，适合MPK细胞生长的培养基；每升液体培养基含有5～8克的高糖DMEM， 3.5～5.5克的M199， 1.5～3克的NaHCO₃，50～120毫升的牛血清；培养基的pH为7.2～7.4。

5.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于MPK细胞在生物反应器内适宜生长温度为36.5～37.5℃，适宜培养pH为7.0～7.5，适宜溶氧值为25%～85%，适宜搅拌速度为30～120 rpm。

6.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于MPK细胞在反应器内生长时的培养基灌注速度根据培养基中糖类的代谢消耗变化和乳酸的代谢累积变化，阶段性调整灌注速度，每天的培养基消耗量为0.5～5个生物反应器培养体积。

7.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤（3）中细胞经高密度培养后，密度达到8～16×10⁶个/ml。

8.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤（4）中细胞培养基为经优化的维持培养基；每升液体培养基含有5～8克的高糖DMEM， 3.5～5.5克的M199， 1.5～3克的NaHCO₃，50～120毫升的牛血清；培养基的pH为7.2～7.4。