[发明专利]一种呼吸道合胞病毒的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒的检测方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，是引起冬春季婴幼儿下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一。该病毒的传染性强，易引起疾病的暴发流行和严重的院内感染。近来也认为RSV是引起老年人严重呼吸系统感染的重要原因，在养老院中的爆发常常引起肺炎，有证据显示RSV感染也与哮喘有一定联系。Falsey等报道RSV感染成人会加重慢性阻塞性肺病；Elden等报道RSV感染在免疫抑制或缺陷、骨髓移植以及血液系统恶性疾病的病人中死亡率较高。RSV可以用多种细胞株（Hela、Hep-2细胞等）分离培养，其中Hela细胞是最常见的分离RSV的标准工具，以Hela、Hep-2等细胞为工具分离RSV，该方法特异性较强,但其费时长, 一般需1~ 2周才能观察到病变,且成本较高,病毒分离阳性率低；电镜检测法虽是直接检测病毒颗粒,但检出阳性率不高、时间较长,不适合临床快速检测;双抗体夹心ELISA法检测抗原，虽操作方便，但会造成许多阳性样本漏检。病毒核酸检测应用杂交或聚合酶链反应技术,敏感性强,特异性高,能进行微量检测,但实验条件要求严格,成本高,不适合广大基层医院,同时,不能避免出现假阳性或假阴性。目前医院病毒病的病原学检测是一个薄弱的环节，而感染性疾病诊断的金标准是病原学的诊断。JEC细胞系是吴中明等建立的一株子宫内膜腺癌细胞系，对多种病毒敏感。我们的研究发现RSV对JEC细胞的敏感性较高，低滴度的RSV即引起JEC细胞病变效应，用自制RSV血清抗体检测RSV，可在JEC细胞胞浆内发现明显的绿色荧光颗粒。

发明内容

本发明要解决的技术问题：解决目前RSV检测存在的准确度不高、灵敏度不高或成本高的问题，本发明用人子宫内膜腺癌细胞系（JEC）作为工具，分离RSV病毒，用间接免疫荧光法快速、灵敏的检测RSV，与传统方法相比提高了检测的准确度、灵敏度，并降低了检测成本。

本发明的一种呼吸道合胞病毒的检测方法，用子宫内膜腺癌细胞系JEC做呼吸道合胞病毒分离工具，再用间接免疫荧光法检测病毒。

本发明所述一种呼吸道合胞病毒的检测方法，包括以下具体步骤：

（1）培养JEC细胞，JEC细胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置于相对湿度为95﹪～98﹪，37℃，5﹪CO₂及37℃条件下培养；每2～3d换液1次，4～5d传代1次；将生长良好的JEC细胞用0.25﹪胰酶消化后制成细胞悬液，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔培养板，0.1 ml/孔，置于37℃、5﹪CO₂培养箱中培养，次日待细胞贴壁后感染病毒；

（2）RSV感染JEC，用PBS反复冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余PBS液，每孔接种40ul咽拭子液放入含双抗的无菌试管内处理2h，对照孔接种PBS液40ul，感染1-2h后用无血清RPMI1640培养液冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余液体，每孔加入0.1ml维持液，含2%小牛血清的RPMI1640培养液，每8-12h倒置显微镜下观察一次是否出现细胞病变效应，如果72h未见细胞病变效应再盲传一次；

（3）间接免疫荧光法检测RSV ，病毒感染72h后，弃去孔内培养液，PBS反复冲洗96孔培养板三次，然后用冷丙酮固定10分钟，2% Trition-100打孔5分钟，PBS液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:2 RSV抗体5ul，湿盒37℃孵育45分钟，PBS液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:30羊抗鼠IgG FITC二抗10ul，湿盒37℃孵育45分钟，PBS液冲洗三次，3min/次，倒置荧光显微镜观察胞内及包膜绿色荧光，如感染组出现明显荧光颗粒，则有RSV的存在。

本发明达到的有益效果：

（1）提高了检测的灵敏度。